低氧预适应对HT22细胞PP1γ和Reelin表达的影响*

丁继东，许文强，刘晓蕾，邹明新，时静华，邵 国

(1.内蒙古科技大学包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院基础医学与法医学院；3.内蒙古科技大学包头师范学院生物科学与技术学院)

神经细胞对低氧/缺血极为敏感，低氧/缺血是造成的中枢神经细胞损伤是临床常见的基本病理过程和基本死因。大脑的持续低氧会导致神经元的不可逆性损伤，中枢神经系统也会因此产生功能紊乱及病理改变[1]。中枢神经细胞对低氧/缺血具有一定的耐受性，其可根据内外环境的变化来改变基因表达以应对。低氧预适应是一种内源性神经保护机制，可提高机体低氧耐受性，对抗后续损伤。目前认为低氧预适应诱导的应激会触发多基因的适应性反应，最终抵消细胞死亡途径的影响。

蛋白磷酸酶家族庞大，可调控神经元信号转导[2]。作为成员之一的蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase1，PP1)在大脑中含量丰富。PP1包含四个亚基：α、β、γ和δ，其中PP1γ主要分布在核质中，由亚细胞定位和相互作用的伴侣决定其作用底物[2]。Reelin是一种细胞外基质蛋白，主要由大脑皮质的Cajal-Retzius细胞合成分泌，可以通过与不同种类的受体结合而充当信号分子，在皮质发育期间的一些脑组织的层状结构上起重要作用[4]。Reelin受到胞嘧啶的调控[5]，在大脑的学习记忆过程中起着一定的作用，可以通过影响突触的结构和功能特性而发挥作用[6]。

本研究以HT22细胞处于低氧预适应条件下PP1γ和Reelin表达的变化，探讨低氧预适的调控、进而发挥保护作用的机制。

1 对象与方法

1.1实验对象 HT22小鼠海马神经元细胞。

1.2试剂与仪器 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin)(上海晨达医药科技有限公司)，RIPA裂解液(中国碧云天生物技术公司，P0013b)，蛋白酶抑制剂(PMSF)(中国碧云天生物技术公司)，蛋白磷酸酶抑制剂(中国碧云天生物技术公司)，BCA定量试剂盒(美国赛默飞世尔公司)，Sample Reducing Agent 10×(Invitrogen，NP0009)，预染蛋白Marker(美国赛默飞世尔公司)，荧光定量PCR仪(美国ABI公司，ABI17900HT FAST)，蛋白电泳仪电影(美国伯乐，1645050)，CO2培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(美国Thermo公司)，二氧化碳气罐(包头市鑫源气体有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1HT22细胞模型的建立 复苏的细胞培育2～3代后，选择状态数量几乎相同的细胞，随机分为对照组(C)、低氧组(H)和低氧预适应组(HPC)。其中低氧预适应的条件为：低氧(1 %氧气、5 %二氧化碳、94 %氮气)30 min和常氧(21 %氧气、5 %二氧化碳、74 %氮气)30 min，循环交替，共4个轮回。低氧预适应结束后进行13 h的低氧和6 h复氧。低氧组则直接进行13 h低氧，6 h复氧。结束后按需将细胞收集。

1.3.2Real-time PCR检测HT22细胞中PP1γ和Reelin的mRNA表达水平 TRIzol法提取HT22细胞中的RNA并反转录为cDNA，引物由上海生工公司合成，real time PCR结果利用ΔΔCT法分析，ΔCT=CT目标基因-β-actin，mRNA相对丰度值F= 2-ΔΔ。

1.3.3Western Blot检测HT22细胞中PP1γ和Reelin的蛋白表达水平 RIPA法提取HT22细胞中的总蛋白，并用BCA试剂盒测取蛋白浓度。根据样品浓度计算样品上样体积，所有上样质量均为10 μg。电泳完成后使用ECL试剂盒内发光液曝光，保存图像。

1.3.4统计学处理 real-time PCR 和western结果采用GraphPad prism 5软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1低氧预适应降低PP1γ的表达 (1)各组HT22细胞中PP1γ的mRNA表达情况比较：通过Real-time PCR检测可知，与C组、H组相比，HPC组中PP1γ的mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，见图1-A。(2)各组HT22细胞中PP1γ的蛋白表达情况比较：通过WesternBlot对蛋白检测可知，与C组相比，H组、HPC组蛋白表达水平均下降(P<0.05)，且HPC组蛋白表达水平下降更多(P<0.05)。见图1-B、图1-C。

2.2低氧预适应增加Reelin的表达 (1)各组HT22细胞中Reelin的mRNA表达情况比较：通过Real-time PCR检测可知，与C组、H组相比，HPC组中Reelin的mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，见图2-A。(2)各组HT22细胞中Reelin的蛋白表达情况比较：通过WesternBlot对蛋白检测可知，与C组相比，H组、HPC组蛋白表达水平均升高(P<0.05)，且HPC组蛋白表达水平升高更多(P<0.05)。见图2-B、图2-C。

3 讨论

低氧预适应能显著提高海马神经元应对低氧的耐受能力，即当机体发生缺血/缺氧时，低氧预适应能有效减轻该极性条件导致的学习记忆能力下降[1]。根据吕国蔚教授在1963年提出的小鼠低氧预适应模型，本研究前期实验中观察到，小鼠对于低氧耐受的能力随低氧次数的增加而增加，而海马内Reelin和PP1γ的表达都有不同程度的变化[7]。

PP1γ与学习记忆的形成相关，被认为是海马中突触强度和突触可塑性负性调节因子。PP1可以通过多种细胞内机制调节神经传递及学习和记忆过程。低氧时，PP1通过A1R的介导使GluA2和GluA1表达下调，使海马神经元对缺血性损伤的敏感性增加，从而导致神经元损伤[8]。在本研究中发现低氧预适应可降低HT22细胞内PP1γ的mRNA和蛋白表达，因此推测低氧预适应可下调某些不利脑细胞生存的基因从而实现低氧状态下对神经元的保护作用。

Reelin主要由GABA能神经元产生，可能通过调节细胞骨架的肌动蛋白参与突触功能。Reelin缺乏小鼠表现出GABA能受体激活剂的失效，导致无法调节神经元活动[9]。在海马切片过表达Reelin时，因激活NMDARs通路，大量的Ca2+内流导致长时程增强[10]。本实验结果中，低氧预适应可以上调HT22细胞中Reelin蛋白水平，推测低氧预适应可上调某些利于脑细胞生存的基因从而实现低氧状态下对神经元的保护作用。

综上所述，低氧预适应可能通过调节HT22细胞PP1γ和Reelin表达来增加细胞低氧耐受。但对两种基因进行调控的详细机制尚不明确，有待进一步研究。