蒙古黄芪皂苷对拟多动症大鼠神经损伤的保护作用*

赵秉宏，蔚立涛，周劭华， 余艳琴，关明杰

(包头医学院公共卫生学院，内蒙古 包头 014060)

注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder ADHD)，别名多动症，是儿童期常见的神经-心理-行为发育性障碍，其患病率在学龄期儿童居首位。Dalsgaard S评估儿童和青少年时期ADHD的患病率约为5.9 %[1]，李世明等对我国1979-2017年儿童ADHD患病率进行系统回顾，结果显示中国儿童ADHD总患病率为5.6 %[2]。ADHD常共患对立违抗障碍、品行障碍、学习困难等其他精神症状，在儿童中已经报道了这种疾病与游戏成瘾的关系[3],增加暴力犯罪的风险以及反社会人格[4]，如不及时治疗，70 %可持续到青春期，30 %可持续到成人，这给家庭及社会都带来诸多负面影响。

ADHD的主要治疗药物倾向兴奋性类(如哌甲酯)药物，虽然这类药物对ADHD起到一定的效果，但往往会带来各种副作用及用药风险[5]。《皇帝内经》中提出的防病策略“不治已病治未病”是现代“预防为主”的早期思想，中医药疾病预防的宗旨即未病先防，早发现、早诊断、早治疗。蒙古黄芪皂苷作为蒙古黄芪的有效生物活性成分之一，具有多种药理作用。本实验中采用蒙古黄芪皂苷对拟ADHD大鼠进行干预，为其预防ADHD提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及及分组 四周龄SPF级雄性SD大鼠35只，体重(60±10)g(购自北京维通利华)。适应性喂养3d后，将SD大鼠随机分为5组，即模型组、对照组、蒙古黄芪皂苷高、中、低剂量组。饲养于实验中心动物房，饲养环境：温度(24±3)℃，湿度(50 %±5 %)。

1.1.2药物 蒙古黄芪皂苷成分的提取：取黄芪粗粉，用 60 %的乙醇进行2次提取，回收乙醇，浓缩物干燥得黄芪皂苷粗品，制成黄芪浸膏，加蒸馏水溶解，过滤，使滤液通过大孔吸附树脂柱，洗涤树脂柱，收集水洗液，再用乙醇洗脱，收集，回收乙醇，浓缩物干燥得黄芪皂苷。

1.1.3醋酸铅溶液制备 将0.2 g醋酸铅(GBS 04-1742-2004，国家有色金属及电子材料分析)溶于50 mL蒸馏水中，搅拌溶解，而后转入1 000 mL容量瓶，用蒸馏水冲洗烧杯边冲洗边将洗液倒入1 000 mL容量瓶中，重复2～3次，用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.1.4样本采集 末次给药24 h后将大鼠断头置于冰上取脑组织，在冰浴中，用冰生理盐水将脑组织制成10 %的组织匀浆，于低温高速离心机中，设置条件为4 ℃，2 500 r/min，离心20 min后取上清液，置于冰浴中待用。

1.2实验方法

1.2.1模型建造及干预方法 实验开始，对照组自由饮用纯净水，模型组和干预组自由饮用0.2 mg/mL的醋酸铅溶液建造模型，造模的同时对干预组以0.15 g/kg、0.075 g/kg、0.0375 g/kg浓度的蒙古黄芪皂苷(下称黄芪皂苷)溶液灌胃，模型组和对照组以生理盐水灌胃，灌胃量为10 mL·kg-1，连续干预4周。

1.2.2大鼠行为学检测 (1) Morris水迷宫实验：采用Morris水迷宫视频分析系统(成都泰盟软件有限公司，MWT-100)对大鼠的学习记忆能力进行评价。大鼠在水池(直径1.5 m)内完成学习和记忆训练，池水需加入墨水染黑，水池划分为4个象限，于第二象限放置平台，每天将大鼠随机从四个不同的象限入水，记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，最后一天撤去平台，进行空间探索实验，记录大鼠在120 s内目标象限游程比率、时间比率、进入次数。实验前将动物带到实验室熟悉环境，检查标记物位置，水温保持在(25±1)℃。(2)旷场实验：采用旷场实验敞箱(成都泰盟软件有限公司，OFT-100)评估大鼠的行为及自主活动度。规格是52.5 cm×52.5 cm×41.5 cm，测试基底采用九宫格设计。测试前将大鼠带到实验室熟悉环境，测试开始将大鼠放置在中央后，迅速离开拉上帘子，此时另一实验员同时按下监控系统开始键，观察大鼠在实验敞箱内5min的活动情况，监测大鼠的静止时间、运动时间、运动距离。每只大鼠实验后将底板清洗干净，喷洒75 %的酒精并擦干，消除气味，以免对下一只动物造成干扰。

1.2.3大鼠脑神经递质检测 DA、NE、5-HT的测定按照检测试剂盒(购自武汉纯度生物科技有限公司)所示的方法进行检测。将样品，标准品和HRP标记的检测抗体顺序加入到预先用多巴胺抗体包被的包被微孔中，温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化作用下转化为蓝色，并通过酸的作用转化为最终的黄色。黄色的深度与样品中的神经递质呈正相关。用多功能酶标仪(美国BioTek仪器有限公司，SIAFRTD)在450 nm波长处测量吸光度，以计算样品浓度。

2 结果

2.1各组大鼠旷场实验结果比较 与对照组比较，模型组静止时间较对照组减少(P<0.05)，运动时间和运动距离均较对照组增加(P<0.05)，自主活动增多；与模型组比较，黄芪皂苷高剂量组、低剂量组的总运动距离较模型组降低(P<0.05)，静止时间较模型组增加(P<0.05)，运动时间较模型组减少(P<0.05)；黄芪皂苷中剂量组的静止时间、运动时间、总运动距离与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；黄芪皂苷高剂量组的静止时间、运动时间与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠开场实验结果比较

2.2各组大鼠水迷宫实验结果比较 模型组的目标象限运动时间比率、目标象限游程比率与对照组的目标象限运动时间比率、目标象限游程比率的差异具有统计学意义，且模型组低于对照组(P<0.05)；与模型组比较，黄芪皂苷高剂量组的目标象限时间比率和游程比率均高于模型组(P<0.05)；黄芪皂苷中、低剂量组的目标象限运动时间比率、目标象限游程比率、进入目标象限次数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠水迷宫实验结果比较

2.3各组大鼠脑神经递质检测结果 与对照组大鼠比较，模型组大鼠各脑神经递质含量均降低(P<0.05)；与模型组大鼠比较，黄芪皂苷高、中、低剂量组的DA含量均有所上调(P<0.05)；低剂量组的NE含量较模型组上调(P<0.05)；高、中剂量组的NE、5-HT含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑中神经递质含量结果比较

3 讨论

铅作为一种重要的环境毒物，可通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入人体，进入体内的铅可长期蓄积在体内，累及呼吸道[6]、脑组织[7]、胃肠道[8]、骨骼[9]等多个部位，对人体损害极大。儿童时期处于快速生长发育的阶段，这一时期受到铅暴露的神经毒性表现明显，如学习记忆力下降、智力障碍、情绪易激惹等[10]。目前公认的ADHD动物模型是幼年时期的SHR大鼠，该模型特点是更接近儿童ADHD的行为学表现[11]，本次实验采用醋酸铅建造ADHD模型，模拟了儿童摄入铅的途径(手口动作等)，且行为学检测结果：水迷宫结果显示模型组目标象限运动时间比率、目标象限游程比率均与对照组有差异，且低于对照组(P<0.05)，旷场实验结果显示：与对照组比较，模型组静止时间较对照组减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，模型组运动时间和运动距离均较对照组增加(P<0.05)。说明模型组较对照组大鼠表现为学习记忆力减退、多动、焦虑，在一定程度上反映ADHD的临床表现，再辅助生物化学指标的检测，可考虑为ADHD环境因素模型的选择。

蒙古黄芪皂苷是蒙古黄芪的有效成分之一，虽然目前在预防多动症方面少有报道，但已有研究发现皂苷成分具有促神经细胞增值[12]、抗氧化[13]、保护心血管[14-15]的作用，提示蒙古黄芪皂苷可通过对神经的保护与促神经分化作用，防止中枢神经微损伤与神经系统发育迟缓，从而达到预防ADHD的效果，且本课题组前期实验结果表明蒙古黄芪皂苷对ADHD具有一定的改善作用，故本次实验药物选用蒙古黄芪皂苷，Morris水迷宫结果显示：皂苷高剂量组的目标象限时间比率和游程比率均高于模型组(P<0.05)，旷场实验结果显示：皂苷高剂量组、皂苷低剂量组的总运动距离较模型组降低(P<0.05)，静止时间增加(P<0.05)，运动时间减少(P<0.05)，说明低剂量皂苷成分即可对铅染毒拟多动症大鼠起到一定的学习记忆保护和多动行为的防控作用。

有研究表示ADHD的发病机制是多巴胺缺陷造成，由于其发病因素涉及广，目前没有一个单一的系统理论能完全阐明其发病机制，应综合多个因素来看[16]。本实验对ADHD大鼠脑组织中多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺进行检测，结果显示模型组DA、NE、5-HT的含量与对照组比较均有差异，且对照组含量高于模型组(P<0.05)，蒙古黄芪皂苷高、中、低剂量组与模型组比较，DA含量均明显上调(P<0.05)，蒙古黄芪皂苷低剂量组与模型组比较，NE含量上调(P<0.05)，各组间未见剂量反应关系，表明蒙古黄芪皂苷可以上调单胺类神经递质的含量，对拟ADHD大鼠的脑损伤有一定的保护作用。本次实验不能完全说明蒙古黄芪对ADHD的作用机制，后续实验将进一步探讨脑组织病理改变及相关蛋白检测。

实验结果显示蒙古黄芪皂苷可提高拟ADHD大鼠的学习记忆能力，上调单胺类神经递质的含量，提示蒙古黄芪皂苷对拟ADHD大鼠的神经损伤具有一定的保护作用，虽各组间未见剂量反应关系，可设置更多的药物分组进一步探讨不同浓度的蒙古黄芪皂苷对ADHD的防治效果。