不同来源百合HPLC 指纹图谱建立

刘湘丹 陈 娅 刘 霞周日宝裴 刚陈乃宏

（1.湖南中医药大学药学院， 湖南长沙410208； 2.湘户大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室， 湖南长沙410208； 3.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心， 湖南长沙410208； 4.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所， 北京100050）

百合始载于《神农本草经》，其应用历史悠久，属药食同源品种［1］。2015 年版《中国药典》 记载百合来源于百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 或细叶百合Lilium pumilumDC.的干燥肉质鳞叶［2］。其味甘性寒，归心、肺经，有养阴润肺、宁心安神的功效，主要用于治疗肺虚久咳、劳嗽咳血、心烦失眠、情绪不能自主等病［2⁃3］。课题组在收集百合药材过程中发现，卷丹为药用主流品种，市场售价相对便宜；百合为食用百合主流品种，售价较贵；细叶百合市场上基本不见流通；市场还存在非药用品种入药情况；食用百合除百合主流品种外，卷丹、兰州百合亦食用。以上不同来源百合饮片性状比较相似，无经验人员无法准确鉴别，2015 年版《中国药典》 百合药材质量评价依据仅为性状薄层鉴别及水溶性浸出物含有量，无具体品种的鉴别方法，难以保障入药的准确性。基于此，本实验拟利用HPLC 法建立不同来源百合指纹图谱并进行补充研究，以期为中药材百合的质量控制、确保用药准确性及进一步开发利用百合资源提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent Technologies 1260 Inginity HPLC （美国Agilent公司）；BCD⁃452WDPF 冰箱（青岛海尔服务有限公司）；Eco⁃S15 实验室纯水系统 （上海和泰仪器有限公司）；ME204E／02 电子分析天平［瑞士梅特勒⁃托利多仪器（上海） 有限公司］；中草药粉碎机（天津市泰式特仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 王百合苷A 对照品（实验室自制，纯度≥98%）。甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，长沙分路口塑料化工厂）；乙腈（色谱纯，德国默克公司）。有机针筒过滤器（0.22 μm，上海兴亚进化材料厂）。

课题组于2017 至2018 年共从产地收集36 批百合样品（包括药用百合、食用百合、百合药材混伪品），经湖南省药检所方石林教授、湖南中医药大学周日宝教授、刘塔斯教授、湖南中医药大学第一附属医院张志国教授、湖南农业大学谢红旗教授鉴定为百合科相关品种鳞叶的加工品，根据2018 年12 月3 日发布实施的中华中医药学会中药材商品规格等级百合团体标准（T／CACM 1021.21⁃2018）［4］将收集的百合药材进行分级，具体信息见表1。其中野生百合，为课题组野外采集，并于实验室加工，经鉴定其为百合科植物百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulumBak⁃er。

表1 样品信息

其中来源于植物卷丹L.lancifoliumThunb.的干燥肉质鳞叶，按基原分类，习称“卷丹百合”；来源于植物百合L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker 的干燥肉质鳞叶，按基原分类，栽培品习称“龙牙百合”，野生品习称“野生百合”；来源于植物细叶百合L.pumilumDC.的干燥肉质鳞叶，按基原分类，习称“细叶百合”；来源于植物兰州百合L.davidivar.unicdorcotton 的干燥肉质鳞叶，按基原分类，习称“兰州百合”；来源于川百合变种的药用百合混伪品因其开黄花，习称“金百合”。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Supersil ODS⁃B 100 A 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，程序见表2；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL／min；检测波长310 nm；进样量10 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液制备 精密称取王百合苷A 对照品适量，用75%甲醇溶解制得质量浓度为0.1 mg／mL 的王百合苷A对照品溶液，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，密封，低温避光保存，备用。

2.3 供试品溶液制备 精密称取百合样品粉末（过3 号筛） 3 g，置带塞锥形瓶中，加入75%甲醇溶液60 mL，称定质量，静置2 h 后，室温超声30 min （500 W，40 kHz），待冷却用75%甲醇补足减失质量，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取S1 号样品，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次，记录色谱图。以王百合苷A 为参照峰，测得10 个共有峰相对保留时间RSD 均小于0.71%，相对峰面积RSD 均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取S1 号样品（6 份），每份精密称取3 g，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，记录色谱图。以王百合苷A 为参照峰，测得10 个共有峰相对保留时间RSD 均小于0.5%，相对峰面积RSD 均小于4%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称取S1 号样品3 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样，记录色谱图。以王百合苷A 为参照峰，测得10 个共有峰相对保留时间RSD 均小于0.8%，相对峰面积RSD 均小于5%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.4 参照峰选择 在各批卷丹百合样品和各批龙牙百合色谱图中王百合苷A 分离良好，峰形稳定，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定王百合苷A 为参照峰（S）。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 各来源百合指纹图谱 取表1 中百合样品，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样，记录色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012） ” 对各来源样品HPLC 色谱图进行多点校正，全谱峰匹配（时间宽度为0.10），用中位数法生成对照图谱R，计算相似度。通过软件计算，20 批卷丹百合样品，在检测到的44 个色谱峰中，确定了10 个共有峰，占总峰面积的76.59%，20 批样品与对照图谱的相似度0.964～0.997 之间，表明卷丹百合样品相似度良好。20 批卷丹百合色谱图及指纹图谱见图1，卷丹百合对照指纹图谱见图2。以王百合苷A 为参照峰，卷丹百合样品相对保留时间和相对峰面积分别见表3～4。

图1 20 批卷丹百合HPLC 指纹图谱

图2 卷丹百合对照图谱

通过软件计算，10 批龙牙百合样品，在检测到的11 个色谱峰中，确定了5 个共有峰，占总峰面积的86.84%，10批龙牙百合药材与对照图谱的相似度0.986～0.999，表明各来源龙牙百合样品相似度良好。10 批龙牙百合色谱图及指纹图谱见图3，龙牙百合对照图谱见图4。以王百合苷A为参照峰，龙牙百合样品的相对保留时间和相对峰面积分别见表5～6。

野生百合色谱图见图5，较龙牙百合色谱峰更丰富。细叶百合色谱图见图6，较卷丹百合、龙牙百合有明显区别。兰州百合为食用百合之一，通过软件计算，2 批兰州百合在检测到的22 个色谱峰中，确定了12 个共有峰，相似度分别为0.992、0.913，相似度良好，色谱图见图7。金百合色谱图见图8，较卷丹百合、龙牙百合有明显区别。

2.5.2 各来源百合指纹图谱比较 将卷丹百合、龙牙百合、细叶百合、兰州百合、金百合、野生百合图谱进行比对，结果见图9。通过比对分析发现不同来源品种间相似度均小于0.9，表明本研究建立的指纹图谱条件可将以上品种进行区分。

2.6 特征峰指认 为进一步确认百合特征峰的化学信息，采用HPLC⁃ESI⁃MS 对卷丹百合样品10 个共有峰、龙牙百合样品5 个共有峰中的3 个色谱峰进行指认，通过查阅文献数据及与对照品对照，分别鉴定为王百合苷D、王百合苷A、王百合苷E，结果见表7。

表3 20 批卷丹百合共有峰相对保留时间

表4 20 批卷丹百合共有峰的相对峰面积

图3 10 批龙牙百合HPLC 指纹图谱

图4 龙牙百合对照图谱

表5 10 批龙牙百合共有峰相对保留时间

表6 10 批龙牙百合共有峰的相对峰面积

图5 野生百合中王百合苷A HPLC 色谱图

图6 细叶百合中王百合苷A HPLC 色谱图

图7 2 批兰州百合样品HPLC 特征图谱

图8 金百合中王百合苷A HPLC 色谱图

图9 不同来源百合图谱重叠图

3 结论与讨论

现代研究表明，药用百合鳞茎中主要含有酚酸甘油酯、酚酸甘油苷、甾体皂苷、甾醇、黄酮、苯丙素、多糖类、生物碱及磷脂、无机盐等，其中王百合苷A 为酚酸甘油苷类［5⁃10］。文献研究也发现王百合苷A 具有抗氧化、抗肿瘤、抗增殖、免疫调节及雌激素活性等作用［11⁃15］，课题组前期HPLC 和HPLC⁃MS 预实验研究发现，以上不同来源百合样品中都含有王百合苷A，其响应值高分离度好，相对百分含有量较高；课题组也从卷丹中分离得到王百合苷A，因此选王百合苷A 为参照峰。

卷丹百合为市场药用百合的主要来源，本研究共收集到20 批样品，未收到符合中华中医药学会发布的中药材商品规格等级百合团体标准（T／CACM 1021.21⁃2018） 的一等品；龙牙百合药食皆用以食用为主，本研究仅收集到10批样品；细叶百合为《中国药典》 中百合3 个来源之一，但课题组在药材收集过程中发现，其在市场基本不见流通，仅收集到一批样品；兰州百合为食用百合，作为研究对照收集了2 批样品；金百合为川百合的变种，开黄花，饮片与卷丹相似，微苦，药材收集过程中发现其作百合入药，为市场百合药材混伪品，本研究收集到1 批样品；还特从野外采集了2 批野生百合样品进行对照研究。

表7 百合特征峰质谱数据

本研究对20 批卷丹百合样品进行了分析，有10 个共有峰，样品间相似度均大于0.9，不同等级卷丹百合指纹图谱无明显差异；分析10 批龙牙百合样品，有5 个共有峰，样品间相似度均大于0.9，不同等级龙牙百合指纹图谱亦无明显差异；表明卷丹百合、龙牙百合都有稳定的HPLC 指纹图谱。本研究采集2 批野生百合、1 批细叶百合、2 批兰州百合和1 批金百合进行对比研究。以龙牙百合对照指纹图谱为参照峰，与野生百合图谱进行比对，其相似度0.762～0.879，栽培百合样品中的5 个共有峰都能与2 个野生百合匹配，但发现野生百合各共有峰对峰值明显高，且峰更为丰富。对其他各来源百合色谱峰进行比对分析发现，龙牙百合、野生百合、细叶百合、兰州百合、金百合与卷丹百合对照指纹图谱的相似度依次为0.653、0.593、0.366、0.566、0.568，表明可将卷丹百合与以上来源百合进行区分。细叶百合、兰州百合、金百合与龙牙百合指纹图谱的相似度依次为0.470、0.731、0.767，表明可将龙牙百合与细叶百合、兰州百合、金百合进行区分。细叶百合与金百合比对相似度为0.404，兰州百合与金百合比对相似度为0.640，细叶百合与兰州百合比对相似度为0.410，不同来源品种间相似度均小于0.9。结果表明，本研究建立的方法可将卷丹百合、龙牙百合、细叶百合、兰州百合、金百合进行区分，以期为评价鉴别百合品种来源的研究提供参考。