62株临床分离布鲁氏菌对四种常用抗生素药物敏感性实验

梁英风,吴金英,刘 岩,伊茂礼,周志美

(烟台毓璜顶医院a.检验科；b.感染科， 山东烟台 264000）

布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌引起的一种急性或慢性动物源性传染病，属自然疫源性疾病。该病是我国《传染病防治法》规定的乙类传染病，可造成严重的健康和社会经济损失。全球有近170 个国家和地区的人畜中存在布鲁氏菌病，且成为自90年代中期起报告发病率上升最快的传染病之一[1]。近年来，我国由于牧区分布范围广泛，变化趋势体现为由牧区向半牧半农区甚至农区转化，由聚集暴发向散在发病转化。由于布鲁氏菌病起病隐匿，且临床症状广泛多样(如发热乏力、关节肌肉疼痛、肝脾肿大等)［2］，给临床诊断治疗带来极大挑战，为了使患者得到及时正确的诊断和规范性治疗，现将我院2015～2018年微生物实验室分离出的布鲁氏菌体外药敏试验结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2015年2月～2018年12月我院各临床科室送检的血培养中共分离出62 株布鲁氏菌, 其中呼吸科23 例，关节脊柱科11 例，血液内科9 例，风湿免疫科8 例，消化内科6 例，其余科室共5 例。男性43 例，女性19 例。经查病历发现，62 例病人均有不同程度的发热，最高体温为37.3℃～40.1℃，平均38.7℃。24 例患者有典型的波状热，9 例有弛张热，29 例有不规则发热。所有的病患均有不同程度的关节肌肉疼痛。39 例病程小于1 个月，14 例病程3 个月左右，9 例病程超过3个月。在62 例患者中，36 例有接触牛和/或羊的病史，9 例常吃牛羊肉，5 例喝过羊奶，4 例为厨师，2 例从事生羊皮加工，6 例病史不详。WBC 计数（2.22～14.31）×109/ml，红细胞沉降率大多介于15～61mm/h，4 例在15mm/h 以下。

1.2 试剂与仪器 Bact/Alert 3D 自动血培养仪、VITEK-2Compact 自动细菌分析仪、革兰氏阴性杆菌鉴定卡（GN,法国生物梅里埃公司）、庆大霉素（GEN）、利福平(RIF)、复方新诺明（SXT）、多西环素（DOX）E-test 试验纸片（温州康泰生物科技有限公司），血琼脂平板、M-H 琼脂平板（济南百博生物）。

1.3 方法

1.3.1 细菌的培养与鉴定：血液经Bact/Alert 3D 自动血培养仪培养报阳后，查看报警曲线，立即用无菌注射器抽取瓶中液体涂片，同时转钟血琼脂平板置于35℃，5%（v/v）CO2温箱中培养。革兰染色后镜下可见革兰阴性短小球杆菌，着色较弱，菌体排列如细沙样团状，培养48h 后血平板可见圆形细小菌落，表面光滑稍隆起，呈灰白色。获得的纯培养细菌用VITEK Ⅱ自动细菌分析仪来鉴别菌种。

1.3.2 药物敏感性及判断标准：布鲁氏菌属的药敏试验没有扩散法的折点标准，常用药稀释法折点标准为庆大霉素：≤4μg/ml 为敏感，多西环素：≤1μg/ml 为敏感，复方新诺明：≤2/38μg/ml 为敏感，利福平暂无敏感标准。本试验中菌株的MIC是用E-test 试验方法测得。将0.5 麦氏单位的菌液涂布在血M-H 琼脂平板上，5 min 后贴药敏纸片。室温放置10min 后，将平板放置于35℃温箱培养24h。抑菌率根据CLSI M100-22 标准（非肠杆菌科细菌的MIC 值解释标准）得出，由于布鲁氏杆菌的致病性及以往实验室感染的报道，我们实验室医务人员均穿防护服，佩戴口罩、手套，所有标本操作都在二级以上的生物安全柜内进行。

1.3.3 诊断标准：卫生部地方病防治司颁布的布氏杆菌病诊断标准规定，有流行病学接触史，符合布鲁氏菌病临床症状和体征，同时血清凝集试验、补体结合试验及抗人球蛋白试验任一项阳性者即可确定为布鲁氏菌病患者［3］。

2 结果

2.1 细菌的生长特点和菌株鉴定 62 例血培养平均报警时间是42.7h，最短29.3h，最长57.9h。转种的血平板于35℃温箱培养48h 后，可见圆形，突起，乳白色，湿润的不溶血菌落，菌落大小1～2mm。革兰染色呈革兰阴性短小球杆菌，细小，分布如沙滩状。VITEK Ⅱ自动细菌分析仪鉴定结果均为马耳他布鲁氏菌。

2.2 MIC 值药敏试验结果 经测定，庆大霉素MIC 值 为0.5～0.75μg/ml，其 中0.5μg/ml 27 例，0.75μg/ml 35 例；利福平MIC 值为0.06～2μg/ml，其 中0.06μg/ml 21 例，0.75μg/ml 16 例，2μg/ml 25 例；复方新诺明MIC 值为4 ～16μg/ml，其中4μg/ml 27 例，8μg/ml 21 例，16μg/ml 14 例； 多西 环 素MIC 值 为8 ～32μg/ml，其 中8μg/ml 26例，16μg/ml 22 例，32μg/ml 14 例。四种抗生素MIC50，MIC90 值及敏感率见表1。

表1 62 株布鲁氏菌四种抗生素MIC50，MIC90 值（μg/ml）及敏感率

3 讨论

布鲁氏菌感染剂量很低，可使被感染的雌性动物流产，牛、羊、猪是布鲁氏菌最易感的动物。被感染的动物持续排菌，通过分泌物和排泄物（牛奶、精液、阴道分泌物、粪便和尿液）排出。病原体可通过体表皮肤黏膜、消化道、呼吸道等侵入人体引起布鲁氏菌病。人的感染途径与职业、饮食和生活习惯有关［4］。近年来，布鲁氏菌病在人类和动物间的传播有明显上升趋势。由于布鲁氏菌为胞内寄生菌，可侵入许多脏器，而抗生素和抗体又很难进入细胞内，这就使得布鲁氏菌病的治愈非常困难。

布鲁氏菌病根据病程可以分为急性期（6 个月以内）和慢性期（超过6 个月）［1］。急性布鲁氏菌病能引起系统性网状内皮细胞增生，常伴有化脓及神经、循环和生殖等系统的损伤，尤其是骨关节系统的损害。然而，慢性期的特点是组织细胞增生和肉芽组织形成。在一些病人中，肉芽组织发生纤维硬化是后遗症产生的基础［5］。

本次试验中，庆大霉素和利福平均属于抗生素，其中利福平杀菌机制为阻断细菌RNA 和蛋白质的合成，对细胞内外的细菌均有明显的杀菌效果［6］，而本实验中RIF 的MIC 值在低水平有较好的杀菌活性。利福平长期以来被视为治疗布鲁氏菌病的首选药，而且它的临床治疗总体上是安全的，但是考虑到药物的毒副作用，如骨髓抑制、肝功能损伤、胃肠反应等，可暂缓使用或改用其他可替代的药物或联合用药治疗。庆大霉素属于氨基糖苷类抗菌药物，也有较高的杀菌活性，但是他们用于治疗布鲁氏菌病的报道很少。多西环素的MIC 值在62 例菌株中均超过8μg/ml，最高达32μg/ml，这与几年前的报道一致［7］，且不良反应最少，联合用药时会权衡进行选择。复方新诺明的杀菌率较低，根据抗菌活性它不能单独作为布鲁氏菌病的治疗用药。

此次研究的62 例马耳他布鲁氏菌病患者，在被诊断为布鲁氏菌病后接受了口服利福平和多西环素，随后即被转往传染病医院进行进一步治疗。经随访在用药2 周后，大部分病人有不同程度的好转，另有12 例因联系方式有误等原因未联系到病人，无法对其进行追踪与随访，他们的治疗进展无从而知。对布鲁氏菌病治疗的失败，除细菌本身的特性外，还有一个重要原因就是选药不当或疗程不足所致。布鲁氏菌病的治疗可参考卫健委印发的布鲁氏菌病诊疗指南［7］，基本原则是：早期、联合、足量、足疗程用药。为减少复发和防止耐药菌株的产生，一般联合两种抗生素治疗2～3 个疗程。无并发症的非复杂性感染临床常用的抗生素物组合为：多西环素（6 周）+庆大霉素（1 周）、多西环素（6周）+利福平（6 周）或多西环素（6 周）+链霉素（2 ～3 周）等［1］。复发病例多因药物治疗依从性差，未满疗程停药，而非耐药菌的产生，可用原方案再治疗1 个疗程。无论何种治疗方案，治疗过程中要注意监测患者血细胞检测、肝肾功能等。我国是抗生素应用大国，耐药性问题不容忽视，国外有文献报道，布鲁氏杆菌对利福平的敏感性降低［9］，我国尚无耐药性研究，有待较大规模的调查以明确我国布鲁氏菌的耐药现状。为了使患者早日康复，临床医生应该根据个体差异和药物敏感试验结果，合理灵活地选择抗生素。

本文不足之处，由于本院为本地区较大的综合型医院，确定患者来源较为困难，无法判断不同区域患者之间药物敏感性是否存在差异，同时因确诊布鲁氏菌病后患者均被转到当地传染病医院，对联系方式有误的患者无法对其后续治疗进一步随访，因此对病程和治疗结果无法得知。如果能够完善患者信息，加强不同区域流行病学调查和宣传教育，相信对进一步降低布鲁氏菌病的发病率大有帮助。