利培酮片人体生物等效性研究

江苏恩华药业股份有限公司，徐州221007

利培酮（Risperidone）为苯异恶唑衍生物，具有较强的中枢5-HT,尤其是5-HT2A 和D2 受体的拮抗作用，临床主要用于治疗急性和慢性精神分裂症，以及其它各种精神病性状态的明显的阳性症状和阴性症状[1]。帕利哌酮（Pallipiperidone）是利培酮在体内经CYP2D6 和CYP3A 酶转化生成的代谢物[2]，药理活性是利培酮的70%[3]，是利培酮片的临床活性成分之一。本试验建立了灵敏可靠的LC-MS/MS 方法检测血浆中利培酮和帕利哌酮的浓度，计算空腹和餐后状态下两者的药代动力学参数，以评估2 种利培酮片的生物等效性。

1 资料与方法

1.1 药品与仪器

药品：受试制剂（T）：利培酮片，江苏恩华药业股份有限公司，1 mg，含量98.8%，批号：S20 170604；参比制剂（R）：利培酮片，美国杨森制药有限公司，1 mg，含量95.6%，批号：16DG442X；乙腈为分析纯；试验用水为超纯水。

仪器：高效液相色谱仪，岛津公司；质谱：Applied Biosystems/Sciex；数据采集：Analyst 1.6.2，Analyst 1.6.3，AppliedBiosystems/Sciex；数据处理：Watson LIMS 7.5 SP1，Microsoft Office 2007 或其他版本；MSA6.6s-000-DM 百万分之一天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 受试者选择

本研究经中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准。所有受试者均签署知情同意书。

空腹和餐后试验各48 名健康受试者，年龄18～42 岁；体重指数在19～26 kg·m-2；无异常的实验室监查，无显著的临床症状；无不良嗜好；试验前两周内未使用任何药物；本试验服药前一个月内未参加过任何药物临床试验。

1.3 试验设计

1.3.1 随机分组方法 空腹及餐后研究均采用单剂量、开放、随机、两周期、两序列自身交叉试验设计。空腹及餐后研究各计划入组48 例受试者，两部分筛选及随机分组方法一致，各部分均分两批进行筛选和试验，每批计划入组24 名受试者。

第一批筛选合格的24 名受试者编号为001～024，若多于24 例，则作为备选者；第二批筛选合格的24 名受试者编号为025～048，若多于24 例，则作为备选者。每批分别采用区组随机化方法产生的随机表，将受试者随机分为I 组和Ⅱ组。I 组受试者第一周期服用受试制剂（T），第二周期服用参比制剂（R）；Ⅱ组受试者第一周期服用R，第二周期服用T。

1.3.2 给药及采血 给药当天早晨已于隔夜空腹至少10 h。餐后组进食高脂高热早餐，并在30 min内用餐完毕。于进餐后30 min 时服药。第一周期I组空腹服用受试制剂1 mg，Ⅱ组空腹服用参比制剂1 mg；均约240 mL 温开水送服。受试者服药后保持半卧位约4 h。

在给药前（服药前60 min 内视为0 h）和服药后10、20、30、45 min，1.00、1.33、1.67、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00、14.00、24.00、36.00、8.00、72.00、96.00h 采集静脉血，每次取血约4mL 至EDTA-2K 抗凝采血管中，摇匀，于采样后1 h 内置2～8 ℃2000×g 离心10 min，分离血浆，低温保存待测。

经约2 周的清洗期进行第二周期试验。除药物交叉外，其余试验步骤同第一周期。

1.3.3 分析检测 血浆样本处理：精密取待测血浆50.0 μL 加入50.0 μL 的内标工作溶液（5.00 ng·mL-1/5.00 ng·mL-1，利培酮-d4/帕利哌酮-d4溶液），振摇1 min，加入200 μL 的乙腈，剧烈振摇约10 min，室温条件下以4000 r·min-1离心10 min，取100 μL 上清液，用200 μL 超纯水稀释，充分振摇10 min 进行LC-MS/MS 分析。

色谱条件：Waters 色谱柱Atlantis T3（2.1×50mm，5 μm）；流动相A 含0.1%甲醛（FA）和5.00 mmol·L-1NH4Ac 的水溶液，流动相B 含0.1%FA 的乙腈（流动相梯度洗脱程序：0.00～3.00 min，A∶B=78%∶22.0%，3.10～3.60 min，A∶B=10%∶90.0%；3.70～5.00 min，A∶B=78%∶22.0%）；流速：0.400 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积5.00 μL。

质谱条件：电喷雾离子化，正离子模式，MRM，喷口电压4000 V，气帘气压力（CUR）241 kPa，雾化气压力（GS1）345 kPa，辅助气压力（GS2）345 kPa，离子源温度（TEM）550 ℃，碰撞气体CAD 9Unit。监测的反应离子对： 利培酮 ［MH］+m/z 411.2 →m/z 191.1，帕利哌酮［MH］+m/z 427.0→m/z 207.0；内标利培酮-d4［MH］+m/z 415.2→m/z 195.1；帕利哌酮-d4［MH］+m/z 431.2→m/z 211.1。

1.4 数据统计分析

药动学参数采用WinNonlin 6.4 软件进行统计分析，Cmax、Tmax均为实测值，AUC 用梯形法计算。采用BES，将Cmax、AUC0-t和AUC0-∞经对数转换后进行方差分析（ANOVA），分析给药序列间、制剂间、周期间差异的统计学意义。采用BES，将Cmax、AUC0-t及AUC0-∞在进行对数转换后进行双向单侧t 检验，进行等效性评价。计算主要指标的几何均值比率（受试制剂/参比制剂）的90%置信区间，如在等效区间（80.00%～125.00%），判断为生物等效。同时计算参数的个体内变异系数和把握度。

2 试验结果

2.1 方法学验证

本试验建立了检测血浆中利培酮和帕利哌酮浓度的LC-MS/MS 法并进行了方法学验证。利培酮的线性范围为0.050 0～30.0 ng·mL-1，帕利哌酮0.050 0～15.0 ng·mL-1；利培酮的批内和批间精密度分别为8.6%和7.8%，准确度分别为-11.3%～4.2%和-4.0%～1.0%；帕利哌酮批内和批间精密度分别为6.6%和6.7%，准确度分别为-8.7%～7.6%和-2.7%～3.2%。利培酮和帕利哌酮及其内标的提取回收率均＞90.6%，精密度均＜3.0%。利培酮和帕利哌酮出峰位置干扰峰的平均响应值均不超过定量下限（LLOQ）标准曲线样品平均响应值的10.3%，内标均不超出LLOQ标准曲线样品平均响应值的0.1%，且利培酮与利培酮-d4，帕利哌酮与帕利哌酮-d4之间互相无干扰。利培酮和帕利哌酮的基质效应，包括溶血和高脂基质效应精密度均＜5.4%，准确度均在86.3%～101.1%。利培酮和帕利哌酮样品离心分离前基质中待测物冰浴2.0 h 稳定，生物样品前处理过程中室温15.8 h稳定，制备后样品8 ℃处理后样品再进样5 天20 小时稳定，-20 ℃/-70 ℃5 个冻融循环稳定，生物基质中-20 ℃61 天稳定，-70 ℃61 天稳定。以上表明，本试验建立的LC-MS/MS 分析方法灵敏、可靠，可用于血浆中利培酮和帕利哌酮的浓度检测。

2.2 药动学参数

健康受试者在空腹和餐后状态下口服受试制剂和参比制剂的平均血药浓度-时间曲线图见图1和图2，药动学参数见表1 和表2。

图1 空腹状态下利培酮和帕利哌酮的平均血药浓度-时间图

2.3 生物等效性

图2 餐后状态下利培酮和帕利哌酮的平均血药浓度-时间图

表1 空腹状态下利培酮和帕利哌酮的药动学参数

设定利培酮片在人体内的药动学参数Cmax的个体内变异系数为28%，AUC 的个体内变异为30%。在显著性水平α=0.05、把握度（1-β）为80%下，以Cmax的个体内变异系数估算的最低所需受试者为40例，考虑到临床试验可能有一定的脱落，本试验正式试验计划入组48 名受试者。

表2 餐后状态下利培酮和帕利哌酮的药动学参数

空腹试验45 例志愿者完成了两周期试验，纳入BE 集。脱落3 例：2 例第一周期服药后，分别因担心健康问题和严重不良事件中止试验；第3 例因工作调动在第二周期开始前退出试验。纳入BE 集的45 例受试者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义。45 例受试者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义；44 例受试者帕利哌酮AUC0-∞在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义。Tmax两配对样本的非参数检验Wilcoxon 符号秩检验表明差异无统计学意义。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的几何均值比值及其90%置信区间见表3。

表3 空腹状态下利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0－t 和AUC0－∞经对数转化后的（1～2α）置信区间

餐后试验42 例志愿者完成了两周期试验，纳入BE 集。脱落6 例：①1 例因家中有急事，于第一周期给药当天凌晨离开I 期病房，未服药；②有2 例第一周期结束至第二周期入住I 期病房前，未能联系上，中止第二周期试验；另1 例在清洗期自行用药，因上呼吸道感染中止第二周期试验；③还有2例在清洗期自行用药，中止第二周期试验。纳入BE集的42 例受试者的利培酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义。42 例受试者帕利哌酮Cmax和AUC0-t在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义；41 例受试者帕利哌酮AUC0-∞在给药序列间、制剂间、周期间的差异均无统计学意义。Tmax两配对样本的非参数检验Wilcoxon 符号秩检验表明，差异无统计学意义。利培酮和帕利哌酮Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的几何均值比值及其90%置信区间见表3。

2.4 安全性评价

本试验的安全性评价指标含生命体征（包括血压、脉搏及体温）、体重、实验室检查及心电图、不良事件等。空腹试验受试制剂有40 例受试者共发生64 件不良反应，3 例低血压严重程度为2 级，其余均为1 级；参比制剂有39 例受试者发生63 件不良反应，1 例晕厥严重程度为3 级，蛋白尿为2 级，其余均为1 级。餐后试验受试制剂有39 例受试者共发生69 件不良反应，严重程度均为1 级；参比制剂有42 例受试者发生74 件不良反应，严重程度均为1 级。不良反应包括镇静、血催乳素异常、头晕、血压降低等。受试制剂和参比制剂总体耐受性良好。

3 讨论

利培酮是临床常用的治疗精神分裂症药物，属于基本药物目录品种。根据《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》（国办发〔2016〕8 号）要求开展一致性评价工作。帕利哌酮是利培酮的活性代谢物，具有良好的药理活性，依据《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》[4]，本试验采用LC-MS/MS 同时检测血浆中的利培酮和帕利哌酮浓度，以利培酮评价生物等效性，帕利哌酮的相关数据用于进一步支持临床疗效的可比性。

本研究比较了健康志愿者在空腹和餐后状态下、口服1 mg 受试或者参比利培酮片后体内利培酮和帕利哌酮的药代动力学，其得到的结果与已有文献报道基本一致[5，6]，为后续研究提供了依据。

[1-2α]置信区间法计算得出空腹状态下受试制剂和参比制剂利培酮的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的几何均值比的90%置信区间分别为96.68%～109.80%、97.15%～109.62%、96.97%～109.28%，帕利哌酮分别为97.83%～105.49%、96.93%～105.11%、96.68%～105.42%；餐后状态下利培酮分别为87.70%～105.54%、98.31%～109.01%、98.70%～109.95%，帕利哌酮分别为98.38%～105.54%、99.22%～106.28%、99.69%～106.54%。均满足药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则中生物等效性的等效范围要求（80.00%～125.00%），表明江苏恩华药业股份有限公司生产的利培酮片（1 mg）与原研Janssen Pharmaceuticals，Inc 生产的利培酮片具有生物等效性。