复方银花解毒颗粒对干酵母诱导幼鼠发热模型的退热作用研究

储 锦，马星月，秦婷婷，马占强，傅 强，马世平

中国药科大学中药学院，南京211198

复方银花解毒颗粒是由青蒿、山银花、荆芥、薄荷、野菊花、大青叶、连翘、鸭跖草、前胡、淡豆豉等中药制成的颗粒剂，能疏风解表、清热解毒。用于感冒引起的发热、头痛、咳嗽等，临床前研究表明，复方银花解毒颗粒对伤寒、副伤寒、变形杆菌和大肠杆菌内毒素所致的发热家兔有解热作用。为了验证该复方对幼龄模型动物的药效作用，本项目以幼龄大鼠为研究对象，采用干酵母混悬液诱导幼龄大鼠发热模型，观察其退热作用，为该产品临床扩大用药人群至儿童提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级3～5 周龄幼年雄性SD 大鼠200 只，体重在50～70 g，由江苏省青龙山实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0002，实验动物质量合格证号1907040008。

1.2 药物和试剂

复方银花解毒颗粒 （天长亿帆制药有限公司，批号180911）；布洛芬（葵花药业，批号29180412）；干酵母（OXOID 公司，批号2481359-02）；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、cAMP ELISA 试剂盒（均为Elabscience）；内参GAPDH（Proteintech 公司，批号00078425）；一抗核因子κB（NF-κB，批号8424S）、p-NF-κB（批号3033T） 购自Cell Signaling Technology 公司；p-IκB（万类生物科技公司，批号H01022495）；环氧化酶2（COX2，Proteintech 公司，批号00072808）；兔二抗（Bioworld，批号AA01201）；ECL 化学发光超敏显色试剂盒 （上海翊圣生物科技有限公司，批号36208ES60）；PMSF（批号ST505）、RIPA 裂解液（强）（批号P0013B）、5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（批号P0015L）、BCA 试剂盒（批号P0010），均为碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验仪器

电子体温计 （山东尚农电子科技有限公司）；SN3001 全波长多功能酶标仪（Thermo 公司）；全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统、EPS 600 电泳仪（均上海天能科技有限公司）；TE124S 精密电子天平（Sartorius 公司）。

1.4 模型制备与分组给药

将SPF 级3～5 周龄幼年雄性SD 大鼠，适应性喂养3 天，每日早中晚各一次对幼鼠进行测量肛温，每次测温前电子体温计探头涂上凡士林，插入幼鼠直肠2.5 cm（在体温计2.5 cm 用黑色记号笔标记，确保每次插入深度一致），待读数稳定后记录体温值，连续测量3 天，选取体温为36.5 ℃～38.5 ℃、且连续体温变化小于0.3 ℃的动物用于实验[1]。

将筛选合格的幼鼠随机分成空白对照组、模型组、布洛芬组（0.6 g·kg-1）以及复方银花解毒颗粒低中高剂量组（2.5、5、10 g·kg-1）。

第一批幼鼠每组12 只，用于体温检测。第二批幼鼠每组8 只，用于机制研究，在药效显著时取血及下丘脑。连续灌胃给药7 天阿，空白和模型组给予同体积生理盐水。

实验开始前，禁食不禁水6 h，于实验当天早上检测体温3 次，取均值为基础体温，末次给药1 h 后各组动物以10 mL·kg-1剂量皮下注射质量浓度为200 mg·L-1的干酵母混悬液；空白对照组皮下注射等体积生理盐水[1]。

1.5 肛温测试、标本的采集及检测

第一批动物造模后0.5、1、2、3、4、6 h 分别测定肛温，记录数据，与基础体温比较，计算体温变化值（△℃）（测定体温-基础体温）。在第二批动物造模后选择药效显著的时间点，从动物腹主动脉取血，处死后取下丘脑。ELISA 检测该时间点血清中内生致热源IL-1β、IL-6、TNF-α 含量。试剂盒检测下丘脑体温调节介质cAMP 含量。

1.6 Western blot 检测信号通路相关蛋白表达

Western blot 检测下丘脑炎症信号相关COX2的含量，并检测NF-κB 的核转录情况及IκBα 磷酸化水平变化。根据所提下丘脑组织的重量，取所需量的RIPA 裂解液。在使用前加入苯甲基磺酰氟（PMSF），配成裂解缓冲液。按比例加入裂解缓冲液于匀浆器中研磨至组织裂解。收集组织匀浆于离心管中，4 ℃放置30 min，充分裂解后，离心（12 000 r·min-1，4 ℃）30 min，收集上清液。取2 μL 上清液用于检测蛋白的浓度，其余上清液中加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，于100℃沸水浴中加热10min 使蛋白完全变性。室温冷却，样品制备结束进行制胶和SDSPAGE 电泳。参照marker 将目的蛋白所在凝胶切下，采用湿法转膜，室温封闭2h。封闭结束后，取出PVDF膜，用TBST 洗涤1 次。将PVDF 膜蛋白面朝下放入TBST 稀释的一抗中，4℃孵育12h 后，将PVDF 膜转移至TBST 中洗涤3 次。然后在二抗中37℃轻轻摇晃孵育2 h，TBST 洗涤2 次。在PVDF 膜上加入ECL化学发光超敏显色剂，在全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统中显影并采集图像。使用Image J 图像分析软件对采集到的图像进行灰度分析。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 软件，单因素方差分析统计各项数据。P＜0.05 为具有统计学显著性差异。

2 结果

2.1 对干酵母致幼鼠发热体温变化的影响

如图1 所示，与空白对照组比较，模型幼龄大鼠造模后3、4、6 h 体温显著升高（P<0.001，P<0.01，P<0.001），造模3 h 时模型幼鼠体温达到最高。与模型组相比，布洛芬组在3 h 时体温降低显著 （P<0.05）；复方银花解毒颗粒低剂量组、中剂量组在造模后3 h 体温有降低趋势、但是没有统计学差异；复方银花解毒颗粒高剂量组在造模后2、3 h 体温明显降低，具有统计学意义（P<0.01、P<0.001）。

图1 各时间点发热幼鼠体温变化曲线（n=12）

2.2 对干酵母致热幼鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影响

如图2 所示，与空白对照组比较，模型组IL-6、IL-1β、TNF-α 含量均显著升高（P<0.01、P<0.01、P<0.001）。与模型组比较，布洛芬组可降低血清中各炎症因子的水平，其中IL-6 水平的降低具统计学意义。与模型组比较，复方银花解毒颗粒低剂量组能显著降低IL-6、IL-1β 含量（P<0.01、P<0.01）；复方银花解毒颗粒之中剂量组、高剂量组可降低IL-6、TNF-α 含量，具有统计学差异（P<0.05、P<0.05）。

2.3 对下丘脑cAMP 含量的影响

如图3 所示，与空白对照组比较，模型组下丘脑内cAMP 含量显著升高（P<0.001）。布洛芬组、复方银花解毒颗粒低剂量组、高剂量组均能显著降低幼鼠下丘脑内cAMP 含量（P<0.001、P<0.001）。

2.4 对下丘脑NF-κB、IκBα、COX2 蛋白表达的影响

图2 对幼鼠血清内IL-6、IL-1β、TNF-α 含量的影响

图3 对下丘脑内cAMP 含量的影响

如图4 所示，与空白对照组比较，模型组下丘脑内NF-κB、IκBα、COX2 含量均显著升高，具有统计学意义（P<0.001、P<0.001、P<0.01）。与模型组比较，布洛芬组能够显著降低下丘脑内NF-κB、IκBα、COX2含量（P<0.05、P<0.05、P<0.05）。复方银花解毒颗粒组高剂量下丘脑内NF-κB、IκBα、COX2 蛋白表达量与模型组相比也显著下降（P<0.001、P<0.05、P<0.01）。

3 讨论

图4 对下丘脑内NF-κB、IκBα、COX2 含量的影响

复方银花解毒颗粒以“银翘散”为基础化裁而来，方中以山银花、连翘为君药：山银花味甘性寒，气味芳香，具有清热解毒之功，善治温病发热等病证；连翘苦而微寒，轻清上浮；两药既能解表透邪，又能清热解毒。臣药用荆芥、薄荷、豆豉疏散解表：荆芥虽属辛温之品，但温而不燥伍入辛凉清解剂中，可以加强解表透邪之力，方中用此药，凉而又辛；薄荷辛凉，疏散风热而利咽喉；豆豉辛甘微苦弱寒，宣散表邪；共助君药开皮毛而散热于外。佐药为青蒿、大青叶、野菊、鸭跖草：青蒿苦寒清热，芳香透邪；大青叶味苦性寒，清热凉血，尤擅长于清解时祛之热毒；野菊花味苦辛性微寒，清热解毒；鸭跖草味甘性寒，清热解毒，而尤以解热见长。使药前胡辛苦，宣散风热，肃肺化痰。诸多中药合用具有辛凉解表、清热解毒之功。现代药理学研究表明，本品具有较好的抗病毒、抗菌、解热、镇痛和抗炎作用。方中含多样青蒿化学成分，包括倍半萜、二萜、黄酮类等。其中倍半萜类是青蒿发挥作用的主要有效成分，具有多种药理作用，尤显解热抗炎等[2]。已有研究表明，青蒿中多个成分均能降低酵母引起的大鼠体温异常升高，有解热作用[3]。山银花主要活性成分之一为绿原酸，有抗菌、抗炎、抗病毒等作用[4]。荆芥主要成分为挥发油及黄酮类化合物，可以祛风解表，有解热、抗炎镇痛等作用[5，6]。

cAMP 是重要的发热中枢介质，研究表明，下丘脑内cAMP 的浓度随着体温的升高而升高，与体温呈正相关[7]。IL-6、IL-1β、TNF-α 是研究明确的炎症因子，多项研究表明，在体温异常升高时，上述炎症因子水平也呈现上升趋势[8-10]。

本研究发现，模型组体温在造模后3 h 升高最明显，此时复方银花解毒颗粒高剂量组降低体温效果也极显著，表明该颗粒剂有解热的功效。在对比模型组血清中炎症因子水平后发现，复方银花解毒颗粒能显著降低IL-6、IL-1β、TNF-α 含量。复方银花解毒颗粒也可显著减少幼鼠下丘脑内cAMP 含量，提示该颗粒剂具有解热功效。其作用机制与降低脑内cAMP 水平、降低各种炎症因子水平有关，并且高剂量组效果最明显。

在本研究中，复方银花解毒颗粒之中剂量组对发热幼鼠下丘脑内cAMP 含量有降低趋势、但是没有显著性差异，其原因可能是中剂量组降低体温作用较弱，与模型组相比没有显著性差异，从而导致cAMP 含量没有显著降低；另外，中药发挥作用的机制复杂，在幼龄大鼠体内可能较难表现出剂量依赖性。复方银花解毒颗粒中、高剂量组有降低血清IL-1β 含量的趋势、但是没有统计学差异，其可能的原因是幼鼠体内的IL-1β 因子对低剂量组更敏感，中高剂量抑制IL-1β 效果没有低剂量组好，其确切作用机制有待深入研究。

NF-κB 是一种可诱导的真核转录因子，在调控众多参与免疫和炎症反应的基因表达中起着关键作用[11]。在正常情况下，NF-κB 与其抑制性蛋白IκBs 结合形成异三聚体而失去活性[12]。当细胞受外界炎症因子刺激后，NF-κB 的抑制蛋白（IκBα）可发生磷酸化并降解，NF-κB 从NF-κB/IκBα 复合物中解离出来，发生了活化并入核，诱导相关炎症基因的表达[13]。进入细胞核后，NF-κB 可以调节几个基因，其中包括COX2。COX 是产生前列腺素（PGs）的关键酶，会引起一系列的炎症反应[11]。有研究表明，干酵母皮下注射引起大鼠发热后，可激活NF-κB p65 并入核起到转录作用，促进下丘脑COX2 mRNA 表达增加[8]。

本研究发现，复方银花解毒颗粒以及布洛芬均可以通过抑制NF-κB 的活化减少其入核，抑制COX2 活性，从而减少炎症物质的产生，发挥解热作用。同时也可以通过减少IκBα 的磷酸化、抑制NFκB 激活，从而发挥解热、抗炎效果。

综上所述，复方银花解毒颗粒对幼鼠发热模型有较好的解热抗炎作用，使得异常升高的体温恢复正常，可显著降低模型动物体内炎症因子水平，其机制可能与cAMP 信号转导通路和NF-κB 信号通路有关。