顺势康胶囊的鉴别和含量测定方法研究

杭 娟，金 丽，张心悦，卜 莹，张晓丹

无锡联勤保障中心药品仪器监督检验站，南京210002

顺势康胶囊为海军军医大学第二附属医院研制的非标准复方制剂，处方由党参、黄芪、麻黄等9味中药组成，具有补中益气、健脾敛肺、升阳举陷的功效，临床上用于治疗变应性鼻炎、慢性鼻炎、分泌性中耳炎及慢性外耳道炎等[1]。黄芪、麻黄和甘草依次为此配方中的君药、臣药与佐药。黄芪甲苷为黄芪的主要有效成分，常作为含黄芪制剂的质量标准的指标。原质量标准未对黄芪有效成分的含量进行控制，为进一步加强顺势康胶囊的质量控制，本研究优化了薄层色谱法鉴别黄芪、甘草以及麻黄，同时新增HPLC-ELSD 法测定黄芪甲苷的含量，对顺势康胶囊有效地进行质量控制。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；SEDEX75 型蒸发光散射检测器（上海谱质分析检测技术有限公司）；MS105 电子天平、AL104 电子天平（均为Mettler Toledo 公司）；YOKO-ZS 紫外线分析摄影仪（武汉药科新技术开始公司）。

1.2 药品与试剂

顺势康胶囊（批号：160320、160321、160327，海军军医大学第二附属医院制剂，规格：0.5 g/粒）；黄芪甲苷对照品 （纯度：95.8%，批号：110781-201314）、盐酸麻黄碱对照品（纯度：99.7%，批号：171241-201007）、甘草对照药材 （批号：171241-201007），均购自中国食品药品检定研究院；阴性对照制剂由医院自制。

乙腈为色谱纯级，其余试剂均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱法鉴别

2.1.1 黄芪

供试品溶液制备：取顺势康胶囊15 粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取4 g，溶解于20 mL 甲醇中，经1h 的加热回流后，过滤，将所得固体物溶解于20 mL 的1%氢氧化钠溶液中。取水饱和正丁醇液20 mL，振摇提取，分取正丁醇液，水层重复提取一次，合并正丁醇液，用氨试液20 mL 洗涤两次，随即减压蒸干。所得固体物置于2mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

黄芪甲苷对照品溶液制备：精密称取黄芪甲苷对照品，将其溶解于适量甲醇中，即得浓度为1 mg·mL-1的黄芪甲苷对照品溶液。

阴性供试品溶液制备： 取缺黄芪阴性样品，按照供试品溶液制备方法，制得阴性供试品溶液。

薄层色谱鉴别方法： 根据2015 年版 《中国药典》四部[2]，将3 μL 黄芪甲苷对照品溶液和5 μL 供试品溶液、缺黄芪阴性供试品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶6∶2）在10 ℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。经观察发现，在经点样的薄层板上与对照品溶液色谱对应的位置，3 批供试品溶液均出现了颜色相同的斑点，而缺黄芪阴性供试溶液在相同位置上未见相应斑点。见图1。

2.1.2 麻黄

供试品溶液制备：取本品20 粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取8g，加入50mL 沸水溶解，滤过，加入30mL 浓氨溶液，混匀，加入60 mL 乙醚振摇提取，分取乙醚液，挥干，固体物加1 mL 甲醇溶解，即得。

对照品溶液制备：精密称取盐酸麻黄碱对照品适量，用适量甲醇溶解，即得浓度为1 mg·mL-1的盐酸麻黄碱对照品溶液。

阴性供试品溶液制备： 取缺麻黄阴性样品，按照供试品溶液制备方法，制得阴性供试品溶液。

薄层色谱鉴别方法：根据2015 年《中国药典》四部，将2 μL 盐酸麻黄碱对照溶液和10 μL 供试品溶液、缺麻黄阴性对照溶液分别点于硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（5∶1∶0.1）10 ℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。经观察发现，在薄层板上与对照品溶液色谱对应的位置，3 供试品溶液均呈现出颜色相同的斑点，而阴性对照溶液在相同位置上未见相应斑点。见图2。

2.1.3 甘草

供试品溶液制备：取本品15 粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取5 g，加乙醚40 mL 加热回流1 h，滤过，固体物加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，固体物加水40 mL 溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水溶液洗涤3 次，弃去水溶液，正丁醇液蒸干，固体物加甲醇5 mL 溶解，作为供试品溶液。

甘草药材溶液制备： 精密称取甘草药材0.5 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。

阴性供试品溶液制备： 取缺甘草阴性样品，按照供试品溶液制备方法，制得阴性供试品溶液。

薄层色谱鉴别方法：根据2015 年《中国药典》四部，将2 μL 甘草药材溶液和10 μL 供试品溶液、缺甘草阴性供试品溶液，点于硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（波长365 nm）下检视，在薄层板上供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照溶液在相应位置未见斑点。见图3。

图1 黄芪TLC 图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Megres C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（35∶65）；蒸发光散射检测器检测（漂移管温度：100 ℃；载气流速：3 L·min-1）；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样体积：10～20 μL。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不低于4000。

2.2.2 溶液的制备

①对照品贮备液制备：精密称取黄芪甲苷对照品13 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄芪甲苷对照品储备液。

②对照品溶液制备： 精密量取对照品储备液3 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为黄芪甲苷对照品溶液。

图2 麻黄TLC 图

图3 甘草TLC 图

③供试品溶液制备： 取本品15 粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取5 g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50mL，加热回流1h，滤过，并用少量甲醇洗涤锥形瓶及滤器，合并滤液与洗液，蒸干，固体物加水20mL微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次30 mL，合并提取液，用浓氨溶液洗涤2 次，每次50 mL，弃去浓氨溶液，将正丁醇液蒸干，固体物加甲醇溶解，并定量稀释至5 mL 量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

④阴性供试品溶液制备：取缺黄芪的阴性样品，按“2.2.2”之③的具体步骤，制得黄芪阴性供试品溶液。

2.2.3 专属性考察 分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液以及缺黄芪阴性供试品溶液各10 μL。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图4。阴性供试品溶液在对照品相同保留时间处未出现对应色谱峰，表明阴性无干扰。

图4 专属性试验色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密称取黄芪甲苷对照品12.56 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄芪甲苷对照品储备液。分别精密量取黄芪甲苷储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，并各进样20 μL，按“2.2.1”项下的色谱条件测定。将对照品色谱峰峰面积作为纵坐标A，对应的浓度作为横坐标C，以绘制黄芪甲苷对照品标准曲线，得黄芪甲苷回归方程为：

结果显示，当样品中黄芪甲苷的浓度处于50.24～251.2μg·mL-1时，两者之间存在良好的线性关系。

2.2.5 进样精密度试验 精密吸取150.72 μg·mL-1浓度的黄芪甲苷对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，连续进样6 次，记录峰面积，计算相对标准偏差（RSD）为2.22%，显示本法有良好的精密度。

2.2.6 稳定性试验 精密称取批号为160320 的样品，根据“2.2.2”之③的具体步骤，制得黄芪甲苷供试品溶液，将待测样品置于室温下放置0、4、6、8、10、12 h 后，按“2.2.1”色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。结果显示，RSD 为0.78%，表明在室温条件下放置12 h，供试品溶液稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称取6 份批号为160320的供试样品，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录每个样品对应的黄芪甲苷峰面积，根据外标法，计算每个样品中的黄芪甲苷含量。结果显示，黄芪甲苷的平均含量为0.0812 mg/粒，RSD 为1.17%。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取12.62 mg 黄芪甲苷对照品置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.4836 mg·mL-1的对照品溶液。称取6 份同一批号（批号160320）已知黄芪含量（为0.0810 mg/粒）的样品2.5 g，再加入1 mL上述对照品溶液，按“2.2.2”之③项下方法制备供试品溶液，将正丁醇液蒸干，加少量甲醇溶解固体物于5 mL 量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。以“2.2.1”项下色谱条件进样测定，根据外标法，计算样品回收率。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2.9 含量测定 按“2.2.2”之③制备3 批（批号160320、160321、160327） 供试品溶液，后再根据“2.2.1” 项下色谱条件测定3 批供试品溶液中的黄芪甲苷含量。见表2。

表2 3 批顺势康胶囊中黄芪甲苷的含量测定结果（n=2）

根据实际生产情况，比较分析3 个批次样品检测结果显示，以黄芪甲苷含量为参照，本样品中的黄芪甲苷含量不得低于0.050 mg/粒。

3 讨论

黄芪在多个中医药方中均作为君药，而存在于黄芪中的黄芪甲苷是其主要的活性指标物质，在顺势康胶囊的生产中可以作为一项质量评价指标。检测发现，当波长为202 nm 检测样品中的黄芪甲苷含量时，会呈现出一个末端吸收峰，干扰较大。蒸发光散射检测器可以消除紫外末端吸收引起的干扰，是检测黄芪甲苷含量的较好方法[3-5]。

比较了甲醇-水、乙腈-水等不同流动相系统，当采用乙腈-水（35∶65）时，各成分能达到基线分离，黄芪甲苷的峰型好、理论板数高，因此选用乙腈-水（35∶65）作为流动相。

为进一步检测所得试验数据的准确性，比较分析了不同水饱和正丁醇溶液提取次数（3～6 次）对于样品黄芪甲苷含量测定的影响，结果发现，3 次提取与4 次提取所得黄芪甲苷的含量存在较大的差异，然而继续增加提取次数，所得黄芪甲苷的含量未呈现明显的递增趋势。为能完全地提取黄芪甲苷，同时尽可能节约试验资源，故将水饱和正丁醇溶液作为提取试剂，以提取4 次为佳。

顺势康胶囊含有药味较多，成分复杂，本研究所建立的黄芪甲苷测定方法结果稳定，专属性强，可有效地控制该药品的质量。