莱菔硫烷预先给药对兔单肺通气时肺损伤Nrf2蛋白变化及抗肺损伤的机制

李荣华 胡秀才 单士强 李永博 崔文斌 刘玲玲

(沧州市中心医院麻醉一科,河北 沧州 061000)

临床研究证实长时间的单肺通气(OLV)可增加肺损伤发生的危险性，影响患者预后及术后康复〔1〕。核因子NF-E2相关因子(Nrf)2和急性肺损伤的发生密切相关，是机体中调节炎性反应、氧化/还原反应的重要转录因子〔2〕。莱菔硫烷(SFN)主要来源于甘蓝、西兰花、花菜等十字花科蔬菜中，属于可食用的异硫氰酸盐，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎性反应等作用，作为化学预防药物已引起广大研究者的关注〔3〕。研究报道，SFN能有效抑制重症急性胰腺炎大鼠肺组织炎性反应，降低细胞氧化应激水平，减轻大鼠肺脏组织水肿〔4〕。本研究拟评价SFN预先给药对OLV兔肺组织Nrf2蛋白表达的影响及机制。

1 材料与方法

1.1对象 取河北医科大学实验中心24只健康雄性大白兔，平均(5.01±1.21)月龄，体重2.3～3.5 kg，平均(2.86±0.45)kg，按照随机数字表法分为双肺通气(TLV)组、OLV组及SFN预先给药OLV(SFN)组各8只，其中TLV组3～7月龄，平均(4.89±1.12)月龄，体重2.3～3.3 kg，平均(2.81±0.43)kg；OLV组4～8月龄，平均(4.92±1.19)月龄，体重2.4～3.5 kg，平均(2.92±0.46)kg；SFN组3～8月龄，平均(4.05±1.25)月龄，体重2.3～3.5 kg，平均(2.83±0.43)kg，3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。TLV组在气管置入单腔气管导管行双肺通气，OLV组、SFN组在右主支气管置入单腔气管导管行OLV。SFN组于OLV前30 min以5 mg/kg SFN行腹腔注射，OLV组和TLV 组同时点给予等量羟甲基纤维素钠的溶媒。

1.2建立OLV模型 参照林文前等〔5〕研究方法建立OLV诱发肺损伤模型。将大白兔常规禁食水数小时后，给予30 mg/kg、3%戊巴比妥钠于兔右侧耳缘静脉注射进行麻醉后，常规备皮，消毒。将右侧股动脉游离以用于监测平均动脉压(MAP，多道生理记录仪 GY-6000F)及取动脉血行血气分析(美国麦迪卡medica EasyStat 全自动血气分析仪)。给予局麻将颈部皮肤切开，行气管切开术。TLV组在气管置入单腔气管导管(ID3.0 mm)行TLV，OLV组、SFN组在右主支气管置入单腔气管导管(ID3.0 mm)行OLV(DHX-300动物呼吸机，北京金洋万达科技有限公司)。导管位置通过听诊气道压力、右侧呼吸音及观察右侧胸廓运动等变化进行判断及调整。均采用容量通气模式进行通气，参数为氧浓度分数(FiO2)100%，血氧饱和度(SpO2)大于90%，TLV组双肺通气3 h，OLV、SFN组右肺OLV 3 h。将大白兔摆右侧卧位，稳定10 min后将0.1 mg/kg维库溴铵静脉注射于右颈内，等无自主呼吸后将呼吸机连接行机械通气。OLV组、SFN组先行50 min OLV，再行10 min双肺通气(将气管导管退至气管内，通气参数如上)，再将上述通气过程重复一遍。并在左侧5～6肋间作一小切口至白兔胸腔，以对左肺复张及萎缩情况进行观察。在术中给予0.1 ng/kg维库溴铵、1% 1 ml戊巴比妥钠间断追加，以维持肌送和麻醉，再予10 ml/(kg·h)乳酸钠林格氏液输注于右颈内静脉，以补给实验过程中大白兔损失的体液，保障MAP稳定。在通气开始(T0)、通气1 h(T1)、2 h(T2)、3 h(T3)取动脉血检测血氧分压(PaO2)，再计算氧合指数(PaO2/FiO2)。实验结束后将大白兔通过颈动脉快速放血法处死，摘除右肺称湿重(W)，并取肺下叶1×1×2 cm3肺组织分成等大两份，一份通过4℃ 4%多聚甲醛固定待测，另一份先用液氮冻存1 d再转-80℃保存待测。将右肺放在80℃烤箱中烘烤72 h，再称取干重(D)，计算W/D。

1.3肺组织病理学观察 将1.0 cm3肺组织采用4%多聚甲醛固定常规脱水、包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，再通过光学显微镜观察3组肺组织病理学改变，并进行肺损伤评分。每组切片均随机选取10个高倍视野进行评分，取平均值。评估内容包括肺泡内充血、中性粒细胞浸润、肺泡水肿、肺间质水肿等方面，计为0～4分，0分为轻微或无变化，1分为轻度变化，2分为中度变化，3分为重度变化，4分为极重度变化〔6〕。

1.4指标检测 将-80℃保存的兔肺组织取出，通过化学比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量，严格按照试剂盒(深圳子科生物科技有限公司)说明书进行检测。其中通过硫代巴比妥酸法检测MDA浓度，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性。酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8浓度，严格按照试剂盒(合肥博美生物科技有限责任公司)说明书进行检测。兔肺组织中的血红素氧合酶(HO)-1、Nrf2浓度采用Western印迹法〔7〕进行检测。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0软件行t检验、F检验、SNK-q检验、χ2检验。

2 结 果

2.13组各时点氧合指数比较 3组T0、T1时氧合指数比较差异无统计学意义(P>0.05)，T2时OLV、SFN组明显低于TLV组(P<0.05)，T3时OLV、SFN组明显低于TLV组，但SFN组明显高于OLV组(P<0.05)，T2、T3时OLV、SFN组明显明显低于T0时(P<0.05)，见表1。

表1 3组各时点氧合指数比较

2.23组相关指标比较 TLV组光镜下结果显示兔右肺组织中有完整性较高的肺泡结构，肺泡腔内较少炎性细胞浸润，间质轻度增厚，出血少，未见明显渗出；OLV组兔右肺组织中较多肺泡结构消失，肺泡腔内较多炎性细胞浸润，间质增厚明显，出血多，渗出明显；SFN组兔右侧肺组织肺泡结构有破坏，肺泡腔内较少炎性细胞浸润，间质增厚，出血少，少量渗出。OLV组、SFN组Nrf2、HO-1蛋白表达、肺损伤评分、W/D明显高于TLV组(P<0.05)，SFN组Nrf2、HO-1蛋白表达明显高于OLV组，肺损伤评分、W/D明显低于OLV组(P<0.05)，见表2。

表2 3组相关指标比较

2.33组氧化应激及炎性因子指标比较 OLV组、SFN组MDA表达及TNF-α、IL-6、IL-8浓度明显高于TLV组，SOD活性明显低于TLV组(P<0.05)，SFN组MDA表达及TNF-α、IL-6、IL-8浓度明显低于OLV组，SOD活性明显高于OLV组(P<0.05)，见表3。

表3 3组氧化应激及炎症因子指标比较

3 讨 论

非通气侧肺主要是由肺组织的再灌注损伤、复张时机械牵张性损伤及萎陷时的缺氧性损伤所导致，通气侧肺则由通气过量所引起的机械通气性肺损伤及所诱发的肺组织炎性反应所致〔8，9〕。研究报道，OLV所诱发的肺损伤可能和脂质过氧化反应及炎性反应增加密切相关〔10〕。因终末肺泡的氧供主要来源于肺动脉及肺泡内气体，而肺动脉中是混合静脉血，OLV时萎陷的肺泡缺氧及可发生缺氧性肺血管收缩，进而导致肺组织低氧状态。肺泡的萎陷与复张及缺氧可增加氧化应激反应，生成过量的氧自由基，同时可激活中性粒细胞在肺组织中聚集，从而生成大量的炎性介质。生物膜上的不饱和脂肪酸可与氧自由基发生脂质过氧化作用，生成MOD等脂质过氧化物，对生物膜造成破坏，从而可直接对肺实质细胞造成损伤〔11〕。此外MOD等脂质过氧化物还可对肺毛细血管基底膜等肺间质成分，诱发肺水肿。SOD可有效将机体中氧自由基清除，但当MOD等脂质过氧化物过量时可消耗大量SOD，降低血中活性。TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子促发的肺组织炎性反应，可对血管内皮细胞、肺泡上皮细胞造成损伤，导致肺毛细血管通透性增加、肺泡上皮细胞变性坏死及肺血管痉挛，进而引起肺泡及间质炎性细胞浸润、水肿及出血，导致肺损伤〔12，13〕。

Nrf2是调节炎性反应、氧化/还原反应的重要转录因子，正常情况下Nrf2与Keapl结合在胞质中，并在肌动蛋白构成的细胞骨架上固定，不能进到细胞核中发挥转录活性作用，且被相关蛋白酶体途径降解。当细胞受到亲电子化合物、活性氧簇等刺激时，可与Keapl分离，进入细胞核中合成异二聚体结合ARE序列，从而可启动Ⅱ相解毒酶基因及抗氧化应激蛋白基因等受ARE调控的相关基因转录，受ARE调控的基因大多可编码多种抗炎、抗氧化作用的蛋白如HO-1、醌氧化还原酶1等〔14，15〕。其中HO-1具有显著的抗炎、抗氧化作用，可有效抑制炎性反应，降低肺损伤程度。而抗氧化酶类可发挥抗氧化功能，清除自由基，保障肺组织的正常功能〔16〕。SFN属于异硫氰酸酯类，具有保护细胞、抗氧化、抗炎、抗癌等多种生理学功能。研究发现，SFN能通过Nrf2途径上调HO-1、NADPH泛醌氧化还原酶-1等抗氧化酶表达，最终在机体内发挥抗氧化功能〔17〕。周亚东等〔18〕研究指出，SFN可以通过激活动物体内Nrf2信号传导通路，调节下游多种细胞因子表达，进而缓解组织中的炎性反应，推测Nrf2可以当作肺保护性治疗的一个靶点。氧合指数在临床上常用于反映呼吸功能，当低于300 mmHg时可认为有急性肺损伤〔19〕。本研究结果提示，SFN预先给药可减轻肺损伤；另外，SFN可促进肺组织中Nrf2表达，提高HO-1等抗氧化酶浓度，发挥抗氧化、抗炎作用；SFN也可有效抑制肺组织中脂质过氧化反应及炎性反应，可通过激活Nrf2表达，上调HO-1等下游多种细胞因子的表达来发挥抗氧化、抗炎作用及自身的抗氧化、抗炎等生理学功能发挥协同抗氧化和抗炎的双重生物学作用，从而达到肺组织损伤的保护作用。