高盐饮食对盐敏感性高血压大鼠肾脏损伤的影响

任 洁 胡经文 郭统帅 何明俊 刘富强 牟建军

目前，许多国家都有相当比例的高血压患者摄入大量的食盐，约50%的原发性高血压患者对盐敏感，并伴有进行性肾损伤[1]。盐是高血压的重要易患因素，而血压的盐敏感性是血压相对于高盐摄入所呈现的一种升高反应，与氧化应激和炎症反应密切相关[2]。研究[3]发现，肾脏参与血压的调节以及高血压的发病机制。在动物模型中，可以独立地监测遗传因素和饮食因素(饮食中盐的含量)的相互作用[4]，因此，以动物模型为研究对象，研究盐敏感性高血压的发生、发展机制具有一定的实际意义。目前，盐敏感性高血压和相关肾损伤的潜在机制尚不清楚，因此，为了研究盐敏感性高血压大鼠肾脏损伤的机制，本实验检测和分析了盐敏感性高血压大鼠的肾脏炎症和受损伤程度及肾脏中白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表达变化，以期为盐敏感高血压的机制研究提供理论支持和依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及处理 选择西安交通大学医学院医学实验动物中心[动物合格证号：SYXK(陕)2015-002]20只6～8周龄的雄性大鼠(Dahl/SS和SS-13BN各10只)，所有大鼠进行12 h的明暗循环且自由饮水。按照大鼠品系，将20只实验大鼠分为盐敏感性高血压大鼠模型组(Dahl/SS大鼠)与对照组(SS-13BN大鼠)，每组10只。从实验第1天开始，两组大鼠喂食盐含量为8%的高盐饲料(AIN93标准饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司)，正常给予饮用水喂食4周后，用尾动脉测压法进行血压测定，当模型组大鼠血压>140 mmHg，则表明盐敏感性高血压大鼠模型构建成功。此后，分别处死两组大鼠，并分离获取肾脏组织进行下一步实验。

1.2 肾脏组织学与免疫组化分析 取两组大鼠肾脏组织浸于4%多聚甲醛溶液中，常温环境下固定24 h，经全自动脱水机固定、梯度脱水、透明、浸蜡等过程后，进行石蜡包埋，然后切片，在光学显微镜(OLYMPUS，BX53)下观察。

检查分离获取的100个肾小球标本，分析肾小球的损伤分数，以评估肾小球的系膜扩张、硬化和毛细血管塌陷的程度。根据肾小球损伤的面积百分比，将肾小球病变的严重程度进行分级。然后将切片在3% H2O2的甲醇(aladdin，M116115-10L)和5%正常马血清(yuanye Bio-Technology，MP20006-500 mL)中孵育，以使非特异性染色最小化。将切片在37℃下孵育1 h，并在4℃下与第一抗体(羊抗兔抗IL-6和羊抗兔抗IL-1β，NordicMUbio，GAGp(Fc)]一起孵育过夜处理。然后，将切片与第二抗体(IgG，Abcam，ab150117)在37℃下室温孵育1 h，使用DAB试剂盒(中杉金桥，ZLI-9019)可视化信号。

1.3 ELISA检测 收集两组大鼠的肾脏组织，匀浆处理后，取上清液，按照ELISA试剂盒(Raybiotech，ELH-APOC1-1)说明书的方法检测肾脏组织中的Nephrinuria和TNF-α含量水平，用酶标仪(HBS-1096C)在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，根据试剂盒提供的标准品定量，并计算样品浓度。

1.4 RNA提取与RT-PCR反应 采用RNA提取试剂盒(Biotek，RP55011)提取两组大鼠肾脏组织的总RNA，并使用Advantage RT-PCR试剂盒(Solarbio，RP1100-50T)合成cDNA。将获得的cDNA进一步稀释5倍，并在实时PCR反应中，使用Taq Man大鼠特异性引物用于扩增和检测基因的表达。RT-PCR反应程序为95℃变性10 min，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。引物序列如下：IL-6，F：5’-ATTCTACGGGCAAATTTCAGC-3’，R：5’-GAAATTCGATACAAGAAAGG-3’；IL-1β，F：5’-TGTAGCTAGGAAGCACCA-3’，R：5’-TCGTTGTACATAAGGAAAG-3’，GAPDH，F：5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，R：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。GADPH作为内参，使用2-ΔΔCt方法分析数据。

1.5 蛋白免疫印迹分析 采用标准方法对收集的两组大鼠肾脏组织进行匀浆处理，并进行Western免疫印迹分析。在裂解缓冲液(RIPA，Amresco，M329-10ML)中制备组织匀浆液(100 mg肾脏加入1 mL RIPA)。按照BCA蛋白质测定试剂盒(PYH，C503061-1250ASSAYS)的方法测定两组大鼠肾脏组织匀浆液中IL-6和IL-1β蛋白的浓度(每孔20 μg)。使用等量的蛋白质样品(20 μg)进行Western Blot免疫印迹，使用IL-6(1∶1 000)和IL-1β(1∶1 000)的特异性抗体进行孵育，然后与相应的二抗室温孵育1 h。使用增强化学发光(ECL)试剂(Beyotime，P0018FS)进行显影，用GAPDH蛋白(Proteintech，10494-1-AP)作为内参，计算蛋白质相对表达水平。

2 结果

2.1 两组大鼠血压与肾小球组织化学检测 模型组大鼠的收缩压为(183.82±3.87)mmHg，对照组为(129.03±3.94)mmHg，两组大鼠收缩压的差异有统计学意义(t=21.842,P=0.001)。模型组大鼠的舒张压为(167.25±2.63)mmHg，对照组为(129.03±3.94)mmHg，两组大鼠舒张压的差异有统计学意义(t=22.863,P=0.001)。模型组大鼠肾小球损伤区域和程度高于对照组。见图1。

图1 两组大鼠肾小球组织化学检测(×200)

2.2 两组大鼠肾脏中肾Nephrinuria含量与肾损伤评分比较 模型组大鼠肾脏组织中Nephrinuria含量及肾损伤程度评分均高于对照组，两组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组大鼠肾脏中肾Nephrinuria含量与肾损伤评分比较

2.3 两组大鼠肾脏中TNF-α的含量和肾脏组织炎症反应比较 模型组大鼠肾脏组织中的TNF-α含量为(623.14±43.12) pg/mg，对照组为(193.12±10.11) pg/mg，两组差异有统计学意义(t=35.889，P=0.001)。模型组大鼠肾脏组织炎症反应程度高于对照组。见图2。

图2 两组大鼠肾脏组织炎症反应程度(×200)

2.4 两组大鼠肾脏组织中IL-6和IL-1β基因表达情况比较 模型组大鼠肾脏组织中炎症因子IL-6和IL-1β mRNA的相对表达量均高于对照组，两组差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组大鼠肾脏组织中IL-6和IL-1β mRNA相对表达情况比较

2.5 两组大鼠肾脏组织中IL-6与IL-1β蛋白表达情况比较 模型组大鼠肾脏组织中炎症因子IL-6蛋白相对表达量为(1.71±0.08)，对照组为(0.23±0.09)，两组差异有统计学意义(t=43.538,P=0.001)；模型组大鼠肾脏组织中炎症因子IL-1β蛋白相对表达量为(2.23±0.13)，对照组为(0.65±0.21)，两组差异有统计学意义(t=35.354,P=0.001)。

3 讨论

研究[5]发现，盐敏感性高血压与进行性肾损伤有关，能够导致由炎症反应、氧化应激和内质网应激相关因子升高引起的终末期肾病。因此，本研究采用Dahl盐敏感性大鼠(Dahl/SS)建立了盐诱导高血压和肾损伤的大鼠模型，通过组织化学观察和相关炎症因子检测发现，高盐摄取会引起盐敏感大鼠肾脏的损伤和炎症反应。本研究结果可以为临床盐敏感性高血压的深入研究和治疗提供理论参考和实验依据。

在盐敏感性高血压大鼠中，肾脏损伤通常表现为明显的Nephrinuria含量增加和肾小球损伤。高盐饮食会对肾小球造成严重的损伤，且会影响肾脏的正常功能。其中可能的机理是支配肾脏的交感神经，在肾功能中发挥了其生理作用，与它们对肾血流量、肾小球滤过率、肾素分泌以及钠在体内的重吸收调节有关[6-7]。本研究结果发现，模型组大鼠的肾脏组织中Nephrinuria的含量高于对照组，表明钠的摄入或排泄可能与尿多巴胺排泄存在直接关系。此外，钠的摄入还可通过改变神经活动和/或神经递质的储存和释放来影响周围神经系统的功能[8-10]。

组织病理学观察结果进一步表明，高盐饮食对盐敏感性大鼠的肾小管铸型形成和纤维化有显著的促进作用。本研究中，盐敏感高血压大鼠的肾损伤与炎症和氧化应激密切相关。研究[11]发现，高血压Dahl/SS大鼠血管超氧化物浓度升高，血浆H2O2浓度升高，氧化应激增强。在Dahl/SS大鼠中，肾损伤与氧化应激有关，主要表现为降低NO的生物利用度和增加肾脏中超氧化物的产生[12]。研究[13]表明，氧化应激在过量高盐饮食摄入而引起的肾损伤的发生和发展中起重要作用。本研究结果显示，模型组大鼠肾脏损伤程度加重，可能与炎症和氧化应激相关，与上述研究结果一致。研究[1-15]表明，内质网应激是心血管疾病中潜在的炎症介质。本研究结果显示，盐敏感性高血压模型组大鼠炎症相关因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白质表达水平均高于对照组，且肾脏组织炎症反应高于对照组，对肾小球也造成了明显的损伤。

综上所述，高盐食物饮食摄取会对盐敏感大鼠的肾脏造成严重的生理性损伤，引起炎症反应，进而影响大鼠肾小球等肾脏器官的正常功能。