优质早籼不育系HD9802S不育基因tms5的遗传分析及应用研究

张晴雯，马瑞景，张海涛，袁文雅

(湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

HD9802S是湖北大学水稻育种团队培育的优质早籼不育系，具有不育性稳定、品质优、株叶型态好、早熟等优点[1]. 利用HD9802S不育系，湖北大学已培育出两优287(HD9802S/R287)、两优42(HD9802S/R42)等多个优质早籼水稻品种，获得湖北省技术发明一等奖一项(水稻温敏核不育系HD9802S的选育与应用，2015)、湖北省科技进步一等奖两项(国优高产杂交早稻两优42的选育与应用，2014；国标一级超级杂交早稻两优287的选育与应用，2008)、湖北省科技成果推广二等奖一项(国标一级超级杂交早稻两优287的选育与应用，2011). 虽然HD9802S不育系已广泛应用，但其相关的不育基因的克隆及作用机理还不清楚.

HD9802S是温敏不育系，用于两系法杂交育种，目前两系杂交稻的不育系主要是细胞核雄性不育系，且其不育的特性在一定的光温条件下可发生改变，变成可育. 光温敏不育基因根据受不同光温的影响命名为光敏(photoperiod-sensitive genic male sterile, PGMS)基因或温敏(thermo-sensitive genic male sterile, TGMS)基因. 2012年华中农业大学和华南农业大学相继报道了对光敏雄性不育基因pms3的成功克隆和功能分析[2-3]，其中华中农业大学张启发团队从农垦58S中克隆的pms3编码一个1 236 bp的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)，农垦58中碱基G突变成农垦58S中的碱基C，该单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)引起lncRNA二级结构的改变，造成其启动子区域DNA中CG甲基化程度的升高，并抑制了基因在长日照下幼穗中的表达量，导致雄性不育[2]；华南农业大学刘耀光团队从来源于农垦58S的衍生系培矮64S中克隆到光温敏基因p/tms12-1，其与pms3产生相同的SNP，属于同一个基因，研究表明该SNP位于一个21 nt的小RNA osa-smR5864m的第11位上，而osa-smR5864m本身在培矮64S并没有被抑制表达，推测osa-smR5864w可能是通过抑制下游靶基因的表达，最终造成光温敏不育[3]. 2016年华中农业大学张启发团队又从农垦58S中克隆了光敏基因pms1[4]，研究显示pms1基因是一个不完全显性基因，也是编码1个长链非编码RNA，该基因的转录本PMS1T能被micro-RNA2118识别并介导剪接，之后从剪接位点开始形成一串21 nt且为植物特有的非编码RNA最新成员phasiRNA (phased small-interfering RNAs). 农垦58S与可育品种在pms1区间剪接位点下游的24 bp处有1个碱基的突变，这一突变导致农垦58S在长日照下能够产生更多的phasiRNA， 从而造成雄性不育[4]. 除了上述光敏基因的克隆，2014年华南农业大学庄楚雄团队从安农S-1中成功克隆了温敏基因tms5[5]. 研究显示TMS5编码一个RNA酶Z (RNase Zs1)，不育系中单碱基突变(第71位C突变成A)造成RNase Zs1蛋白质翻译提前终止，进一步研究表明RNase Zs1蛋白本身不受温度影响，但其下游作用底物UbL40(泛素核糖体L40蛋白)受高温诱导高表达，不育系中RNase Zs1蛋白功能缺失，不能有效降解UbL40的mRNA，使其在高温下过度积累，导致高温不育[5].

Zhou H等[5]通过测序确定HD9802S中tms5基因位点存在同样位置同样方向的单碱基突变(第71位C突变成A)，至此我们推测不育系HD9802S中的TGMS性状即是tms5突变造成的. 为进一步验证这一推论，我们首先通过测序再次确认HD9802S中存在相同的SNP，其次通过互补实验证明HD9802S不育系在高温下不育的特性可以被野生型TMS5恢复. 同时我们通过基因编辑技术将R287中的野生型TMS5敲除，在高温下R287由可育变成不育，这些遗传实验证据表明tms5即是控制HD9802S在高温下不育的基因，且通过选择合适的受体材料，利用基因编辑技术敲除TMS5基因，可以创建新的优质不育系.

1 材料与方法

1.1 实验材料转基因受体材料HD9802S及R287，由湖北大学水稻育种团队提供；转化骨架载体pCAMBIA1300及pYLCRISPR/Cas9-MH，由武汉天问生物科技有限公司提供.

1.2 实验方法

1.2.1 HD9802S及R287中TMS5基因位点的序列分析 以日本晴(Nipponbare)参考基因组为模板，设计引物，扩增出HD9802S及R287中TMS5基因座位的序列，进行blast比较分析，确定HD9802S及R287中TMS5基因序列.

1.2.2 互补载体的构建及遗传转化 以R287基因组为模板，PCR扩增出整个TMS5基因序列(gTMS5-F + gTMS5-R)，通过酶切重组方法将野生型TMS5基因构建到互补载体pCAMBIA1300上，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将野生型TMS5基因转入受体材料HD9802S，载体构建及遗传转化由武汉天问生物科技有限公司完成. 本实验中涉及的主要引物序列见表1.

1.2.3 基因编辑载体的构建及遗传转化 参考R287中TMS5基因座位的序列，在第一个外显子中设计2个CRISPR/Cas9基因编辑的靶点，同时构建到基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MH上，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将构建完成的基因编辑载体转入受体材料R287，载体构建及遗传转化由武汉天问生物科技有限公司完成.

表1 本实验所用主要引物情况

1.2.4 转基因遗传材料的鉴定及分析 针对互补实验的转基因植株T0代收种﹑T1代共分离检测及育性表型观察，共分离检测主要是通过PCR检测T1代分离群体中转基因单株为阳性的基因型是否与可育的表型完全对应起来；针对基因编辑的转基因植株进行T0代转基因单株的基因编辑结果检测及育性表型观察，基因编辑结果分析主要是通过PCR扩增出编辑靶点位置及附近两端部分序列，进行TA克隆，再测序，比较分析具体的基因编辑结果及可能造成的蛋白编码氨基酸的改变，再结合T0代转基因单株的育性表型，进一步确定基因型与育性表型的对应关系.

2 结果与分析

2.1 HD9802S中tms5基因编码区存在点突变并导致提前终止，R287中TMS5基因位点编码区完全正常2014年Zhou H等[5]从安农S-1中克隆到控制TGMS的TMS5基因，文中对HD9802S也进行测序，结果表明HD9802S中TMS5基因位点存在单碱基突变，为进一步确定HD9802S及R287中TMS5基因位点的序列，我们以日本晴基因组序列为模板，设计引物，PCR扩增出HD9802S及R287中TMS5基因座位的序列并测序，拼接出各自完整的TMS5基因座位的序列，blast比较分析结果显示HD9802S中tms5基因编码区序列与安农S-1及株1S相同(图1A及图1B)，都是在基因编码区第24位氨基酸处突变成终止密码子(TCG突变成TAG)，而R287中TMS5位点的编码区与粳稻参考基因组日本晴及籼稻参考基因组93-11完全相同(图1A及图1C).

图1 不同水稻品种TMS5基因位点部分编码区序列图1A展示日本晴﹑93-11﹑安农﹑安农S-1﹑株1S﹑HD9802S及R287等 不同水稻品种TMS5基因位点部分编码区序列.图1B及图1C分别表示 HD9802S及R287的TMS5基因部分位点的测序序列，红色线段是突变产生位点

2.2 R287中TMS5基因可恢复HD9802S在高温条件下的育性不育系HD9802S在武汉种植时，若在7月之前种植，在生殖转换期是高温(≥28 ℃)，不育[1]；若是在7月中旬之后种植，在生殖转换期是低温(≤23 ℃)，可育. 为进一步验证不育系HD9802S高温不育﹑低温可育的特性是由tms5基因控制，我们将来源于R287的野生型TMS5基因转入HD9802S中，转入的TMS5基因结构如图2A所示，外源片段包括2 006 bp的启动子区域、1 896 bp的基因组上编码区及终止密码子后883 bp，总长4 885 bp，扩增引物为gTMS5-F及gTMS5-R. 互补实验中T-DNA上基因结构图如图2B所示.

图2 TMS5基因结构图及相关转化载体图图2A是互补实验中来源于R287的TMS5基因结构图.图2B是互补载体中T-DNA上基因结构图.图2C是基因编辑 载体中T-DNA上基因结构图.图2D是R287中TMS5基因第一个外显子内2个打靶位点的部分序列图. 基因组中 起始密码子ATG的第一个A作为+1，LB、RB分别是T-DNA左右边界序列，Hyg：潮霉素筛选基因，gTMS5：R287的 TMS5基因，mpCas9：基因编辑Cas9基因，Target 1：基因打靶靶点1，Target 2：基因打靶靶点2，PAM:原间隔基序， U6a-gRNA (Target 1): 靶点1的U6a启动子驱动的RNA表达盒，U6b-gRNA(Target 2): 靶点2的U6b启动子驱动的RNA表达盒

2018年底我们从公司获得独立阳性转基因单株7株(图3A)，之后送海南収种，获得6个单株的T1代种子. 2019年5月在武汉种植这6个T1代家系，同时种植2行20株HD9802S作对照，10月观察表型. 结果显示20株HD9802S几乎完全不育(个别单株有1～2粒种子)，而6个T1代转基因家系中除第6个家系(15棵)全部可育，育性表型没有分离外(原因可能是转基因多拷贝)，剩余5个T1代家系的育性表型均发生分离(即有些单株完全不育，有些单株可育)，具体统计结果见表2.

表2 互补实验T1代表型及共分离结果

为从遗传上进一步证明TMS5基因控制HD9802S育性，我们对互补实验中T1代家系每个单株都抽提DNA，进行PCR阳性检测，检测胶图如下(图3B～3G).

PCR检测结果表明，转基因阳性单株均是可育的单株，转基因阴性单株均是完全不育的单株，T1代分离群体所有单株的基因型与表型完全对应，共分离实验证明HD9802S由不育变可育的特性是由TMS5基因控制的.

图3 互补转基因单株T0代阳性检测及T1代共分离检测图3A是互补实验转基因单株(7株)T0代阳性检测.图3B～3G分别为6个T1代家系的阳性检测(依次分别为 gTMS5-HD9802S-#1至gTMS5-HD9802S-#6). M: DNA标记(DL2000)，NC: 阴性对照， PC: 阳性对照，PCR检测引物为Hyg-F及Hyg-R，产物大小为594 bp

2.3 敲除R287中TMS5基因可使R287由可育变成不育为更进一步从遗传上证明TMS5基因控制育性，同时验证创建新的不育系的可能，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除R287中TMS5基因.针对TMS5基因序列，我们在基因的第一个外显子内设计2个基因打靶靶点(Target 1: GAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG; Target 2: GCTCGGACTGGTCCATGGAGCGG)，将2个靶点的表达盒同时构建到转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH上，转化R287. 用于构建载体的相关引物见表1，构建完成的基因编辑载体T-DNA上基因结构图如图2C，打靶位点的碱基顺序见图2D. 2019年4月我们从公司获得独立阳性转基因单株5株，并于2019年6月在武汉种植，同期种植2行20株R287作对照，10月观察表型，结果显示20株R287完全可育，而5株T0代转基因单株都完全不育. 针对这5株转基因单株，我们首先在2个编辑靶点两端设计引物gTMS5-F1及gTMS5-R1(表1)，PCR扩增并测序，结果显示除第2号单株测序序列可读，剩余4个单株在靶点位置开始出现双峰，说明在靶点位点有编辑发生. 为进一步确定每个单株具体的编辑情况，对4个测序出现双峰的单株的PCR产物进行TA克隆，再随机挑4个单克隆测序，测序结果显示5个单株都有不同情况的编辑，具体每个单株的编辑情况见图4，编辑后造成的影响见表3. 从编辑结果分析，5个T0代转基因单株都造成TMS5编码蛋白的改变，很可能造成蛋白功能失活；从表型上看，5个单株的确都不育，由此我们确定TMS5功能失活可使R287由可育变不育.

图4 基因编辑转基因阳性单株(5株)，编辑单株测序图片图4A显示R287来源的TMS5基因的打靶位点序列图；图4B～4F分别是5个转基因T0代单株(依次是 critms5-#1～critms5-#5)的具体编辑结果；图4G是critms5-#5单株的编辑靶点附近的测序图

表3 基因编辑T0代单株编辑结果总结

3 讨论

3.1 不育系HD9802S的不育基因即是tms5基因，可能来源于安农S-1测序结果表明HD9802S中tms5基因位点存在点突变导致编码蛋白RNase Zs1翻译提前终止，蛋白功能丧失，最终造成温敏不育的表型. 将野生型TMS5基因导入HD9802S后，可使HD9802S由不育变可育；同时在正常可育品种R287中敲除TMS5基因，可使R287 由可育变不育，以上实验从遗传学上证明了HD9802S的不育基因即是tms5基因. 从单个基因序列结果来看，HD9802S的tms5基因编码序列与安农S-1的tms5基因编码序列完全相同，二者存在完全相同位点相同方向的点突变，由于安农S-1最早是在1987年发现，之后被育种家们广泛应用于两系杂交育种[6-7]，而HD9802S最早由湖北大学育种团队在1998年获得，虽然HD9802S的选育从系谱记载上看与安农S-1没有关系[8]，但由于发现较晚，因此我们推测HD9802S的tms5基因很可能来源于安农S-1(原因可能是基因漂移).

3.2 选择合适的受体材料，通过基因编辑技术敲除其TMS5基因可以创建新的优质不育系安农S-1的高温不育﹑低温可育的特性由功能缺失tms5基因控制，通过基因编辑技术敲除TMS5可使受体材料具有TGMS特性. 目前全国多家单位已开展利用CRISPR/Cas9技术敲除特定品种的TMS5基因创建新的不育系的工作[9-10], 各地方单位可以选择本地合适的育种亲本，针对除育性外其它方面都适合作为不育系的亲本材料，测序验证具有野生型的TMS5基因后，通过基因编辑技术敲除其TMS5基因，创建新的优质不育系用于本地的两系法杂交育种.