微管剪切蛋白Fidgetin在黑腹果蝇神经发育过程中的功能初探

王其霖，王珊，李港，毛传樨，金珊

(湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉 430062)

0 引言

微管是一种具有极性的细胞骨架，为长管状的细胞器结构，在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着重要作用[1]. 微管是由α，β两种类型的微管蛋白亚基形成的微管蛋白异二聚体和少量的微管结合蛋白(microtubule associated proteins，MAPs)聚合而成. 在微管动态变化过程中，有两类蛋白参与微管组装和解聚的动态调节[2]. 其中一类是微管稳定因子，包括多种微管结合蛋白MAPs(如Tau、MAP 1和MAP 4)和微管末端协助微管聚合的因子(如EB 1和CLIP 170)等. 另一类是微管去组装因子，参与微管剪切和末端解聚，如Fidgetin、Kinesin、Spastin及Katanin等. 某一蛋白的编码基因发生突变时能够导致某些遗传性疾病的发生，如spastin突变时可以导致遗传性痉挛性截瘫[3]；TUBB3 (β-tubulin isotype III)突变可以导致严重的神经系统疾病TUBB综合症[4]；微管结合蛋白Tau的异常磷酸化可以导致阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease)[5].

Fidgetin是AAA(ATPase associated with various cellular activities)超家族成员之一，与Katanin及Spastin同属于微管剪切蛋白[6].Fidgetin可以在纺锤体的负端剪切微管使其解聚而破坏微管的动态平衡[6]. 该蛋白至少有两个重要的结构功能域，一个是具有ATP酶活性的可以剪切微管的AAA区结构域(ATPase associated with various cellular activities domain, AAA domain)，另一个是具有α螺旋结构，对ATP酶起调节作用的Vps4(vacuolar protein sorting 4，Vps4)碳端区域[7-8]. 从细菌到脊椎动物人类中均有fidgetin的同源基因存在，仅在脊椎动物中存在3个fidgetin同源基因，分别为fidgetin、fidgetinlike1(fidl-1)及fidgetinlike2(fidl-2).果蝇中Fidgetin与脊椎动物的Fidgetin like 1一致性最高. Yang的体外实验显示在细胞核与细胞质中均有Fidgetin like 1分布，而Fidgetin及Fidgetin like 2主要分布于细胞核中[9]. 小鼠的fidgetin发生突变会导致其耳蜗半规管缺失，而半规管的减少或缺失会导致突变小鼠出现左右摇头的行为，突变小鼠还出现了小眼表型，这可能与细胞周期延迟和视网膜神经上皮细胞生长不良有关，以及少量骨骼异常如：颅骨融合、骨盆带发育不全和多指畸形等现象[10].Fidgetinlike1的表达水平受成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)及转化生长因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的抑制，当在MC3T3-E1细胞中加入FGF及TGF-β1后fidgetinlike1表达明显下调[11].在秀丽隐杆线虫中(Caenorhabditiselegans,C.elegans)fidgetinlike1的同源基因是MEI-1，当其发生突变时，导致生殖干细胞停滞于有丝分裂期而导致线虫不育[12]. 微管剪切蛋白Spastin突变导致的遗传性痉挛性截瘫[3]，最近新发现的Paget骨病也是由一种AAA蛋白VCP/p95突变引起的.Fidgetin是第一个被报道的与发育相关的AAA蛋白家族成员[10]. 到目前为止其体内功能尚不明确，特别是对神经系统发育的影响几乎是个空白.

Fidgetin位于果蝇二号染色体的长臂的23E3区，它编码的蛋白质与人类Fidgetin like 1同源性最高，一致性(identity)为30%，相似性(similarity)为48%，与Fidgetin like 2同源性最低(图1). 在过去的数年中，对fidgetin功能的研究主要集中在体外培养细胞、线虫及小鼠组织结构上，体外高表达fidgetin可以完全破坏培养细胞的微管网络，使微管完全消失[13]. Cox等研究发现小鼠胚胎早期就有Fidgetin表达，发育晚期大脑中部分神经节有fidgetin较强的表达[10]. Fidgetin优先靶向富含酪氨酸的动态微管区域，特别是在培养的星形胶质细胞迁移中起重要作用，实验表明Fidgetin能促进源自大鼠脊髓的培养的星形胶质细胞的迁移[14]. Fidgetin作为微管剪切蛋白促进果蝇受损的树突退化[15]. 在斑马鱼中，实验显示Fidgetin like 1通过调节微管末端动态来控制生长锥的导向、形态和行为[16]. Fidgetin-like 2，作为细胞迁移的基本调节因子，使用纳米粒子包裹的小干扰RNA(siRNA)技术在小鼠体内进行靶向使fidgetin-like2功能缺失，可促进伤口闭合和再生[17]. 在体外，来自哺乳动物组织培养细胞的fidgetinlike2的缺失导致细胞运动速率增加超过两倍，免疫荧光分析表明fidgetinlike2通常定位于细胞边缘，重要的是定位于极化细胞的前沿，它调节微管细胞骨架的组织和动力学[18].

图1 人类Fidgetin like 1和果蝇Fidgetin序列对比

1 材料与方法

1.1 果蝇品系见表1.

1.2 Immunostaining和western blotting所使用抗体见表2.

1.3 实验中使用的载体见表3.

1.4 实验中使用的引物见表4.

表1 本文中使用的果蝇品系

表2 本实验使用抗体

表3 实验中使用的载体

表4 实验中使用的引物

1.5 实验方法

1.5.1 sgRNA的设计 本实验运用网页工具CRISPR optimal target finder (网址http://tools.flycrispr.molbio. wisc.edu/targetFinder/) 在fidgetin的序列上设计了两条sgRNA，序列标记为sgRNA 1、sgRNA 2. sgRNA1、sgRNA 2片段大小均在20 bp，在设计的sgRNA1、sgRNA2的5’端添加了BbsI 内切酶的酶切位点，再交由武汉擎科创新生物科技有限公司合成带有BbsⅠ酶切位点的单链sgRNA1、sgRNA2.

1.5.2 pCDF3 sgRNA表达载体的构建 将合成的两条单链sgRNA DNA序列复性(见表5). 用BbsI内切酶切割pCDF3质粒，胶回收得到有BbsI粘性末端的线性pCDF3质粒. 为了使线性的pCDF3质粒与合成的sgRNA复性得到有BbsI粘性末端的短片段双链DNA连接，取0.5 μL线性pCDF 3和4.5 μL双链sgRNA于PCR管中混匀，再加入5 μL solution I，放在酶连仪中16 ℃反应2.5 h. 将酶连产物转入trans1-T1大肠杆菌感受态中(来自全式金生物技术有限公司)，均匀涂在LA(加有氨苄青霉素的LB固体培养基)平板上，于37 ℃倒置过夜培养. 挑取单菌落接种至5 mL LA液体培养基37 ℃培养10 h，抽提质粒并测序，将序列正确的质粒转化至trans1-T1大肠杆菌感受态并涂布至LA平板培养. 挑取单菌落于100 mL LA液体培养基37 ℃培养12 h，用QIAGEN中提试剂盒提取质粒并纯化.由此得到pCDF3-sgRNA质粒表达载体，构建fidgetin无功能突变体果蝇的pCDF3 sgRNA表达载体命名为pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2质粒.

表5 sgRNA1与sgRNA rev结合为双链gRNA

图2 构建fidgetin无功能突变体实验方案图 将sgRNA1、sgRNA2质粒一起注射到nos-cas9果蝇和vasa-Cas9 果蝇胚胎，然后在注射后成活的果蝇中筛选目的果蝇

1.5.3 显微注射 本实验所用的显微注射实验流程主要来自本实验室的成功案例[19-20]. 将pCDF3-sgRNA 1和pCDF3-sgRNA 2质粒混合在一起，总浓度为150 ng/μL，注入nos-Cas9和vasa-Cas9果蝇产的胚胎中，将注射后成活的成虫与Sp/CyO进行单只杂交得到子代F1，待F1羽化后在各个培养管中随机挑选6～8只进行PCR鉴定.将鉴定有转基因果蝇的培育管中的其它F1雄性果蝇与Sp/CyO雌性果蝇进行单只杂交，待后代产出，鉴定F1雄果蝇是否出现突变. 鉴定方法为：提取亲本果蝇的DNA，将其作为模板，用设计好的引物fidgetinF和fidgetinR进行PCR，之后将PCR产物送到擎科生物公司测序，通过测序结果的峰图读出序列，因为非同源末端链接修复，可能会出现移码突变. 构建fidgetin无功能突变体的实验方案如图2.

1.5.4 免疫印迹fidgetin无功能突变体果蝇与野生型果蝇三龄幼虫各取5只，剖出内脏和大脑，留下皮，分别加入50 μL RIPA裂解液(强)和1 μL蛋白酶抑制剂放置于冰上进行研磨，在4 ℃，14 000 r/min离心10 min取上清，测蛋白浓度，配制上样液. 在99 ℃水浴锅中水浴10 min，然后点样、电泳、转膜(将蛋白转移到PVDF膜上). 接着用0.5% PBST(1%PBS+0.5% Tween 20)配5% 的脱脂奶粉进行封闭1 h，加入一抗(anti-Fidgetin)在4 ℃过夜孵育，用0.5% PBST洗一抗1 h，每13 min更换一次PBST. 然后常温孵育二抗2.5 h，洗二抗1 h，每13 min更换一次PBST. 在孵育过抗体的PVDF膜上加入曝光底物，最后显影曝光.

1.5.5 图片采集和数据处理 实验中免疫组织染色均用Zeiss激光共聚焦显微镜LSM710采集，图片采集后用Adobe Photoshop CS 6处理和排版. 本研究所进行的统计学实验都在3个重复以上，每组实验均用GraphPad Prism 5.0 软件进行统计和数据分析，每次实验若包括两组实验数据，则采用t-test进行统计学显著性差异分析，若包括3组及以3组上实验数据，则采用单因素方差分析(one-way ANOVA with Tukey’s test)进行统计学显著性差异分析. 处理的所有定量数据均以平均值±标准误(mean±S.E.M)的形式表示，在统计图上的*表示的意义分别为：P> 0.05，没有*(星号)说明两组数据间差异不具有统计学意义；P< 0.05用*表示，说明两组数据之间差异有统计学意义，P< 0.01用**表示，说明两组数据之间差异有显著统计学意义；P< 0.001用***表示，说明两组数据差异有极显著统计学意义.

2 结果

2.1 sgRNA表达载体的构建考虑到不同的sgRNA可能存在不同的靶向效率，本实验设计了两条sgRNA以确保实验顺利进行，将两条sgRNA1和sgRNA2分别插入pCDF3表达载体中，测序(见图3).

图3 sgRNA表达载体的构建 A)sgRNA1与sgRNA2序列的设计；B)pCDF3-sgRNA表达载体酶切后检测琼脂糖电泳图；C) pCDF3与 sgRNA连接后对表达载体检测琼脂糖电泳图；D)pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2表达载体质粒检测峰图

图4 fidgetin无功能突变体果蝇筛选 A) fidgetinM14-2突变体果蝇测序结果；B)纯合个体fidgetinM14-2突变体果蝇和 野生型果蝇的序列对比，红色标记为fidgetinM14-2突变体果蝇插入的碱基G

2.2 获得fidgetinnull突变体果蝇将纯化过的两个pCDF3 sgRNA质粒稀释至总浓度在150 ng/μL，即pCDF3 sgRNA1质粒、pCDF3 sgRNA2质粒各自稀释至75 ng/μL混匀，注射入nos-Cas9果蝇和vasa-Cas9果蝇的胚胎中(胚胎发育时间为40 min)，总共注射了大约700只卵，成活30只，分别编号为F1～F10(雌性果蝇1～10号)和M1～M20(雄性果蝇1～20号). 将注射后成活的成虫与Sp/CyO果蝇进行单只杂交得到子代F1，待子代F1羽化后在各个培养管中随机挑选6～8只果蝇，提取DNA，用设计好的引物进行PCR，然后将PCR产物送至武汉擎科生物公司测序，根据测序结果的峰图看是否有突变体果蝇产生，经鉴定，在F8、F10、M10、M12、M14这5管中读取到有突变序列，将这5管的子代雄果蝇与Sp/CyO果蝇进行单只杂交，待子代产出，鉴定进行杂交的雄性亲本果蝇，鉴定方法如前述(1.5.3)，最后筛选出M14中的亲本雄果蝇的序列和野生型相比插入了一个碱基G(图4)，导致发生移码突变，命名为fidgetinM14-2突变体果蝇(可简写为fignM14-2).

图5 FidgetinM14-2突变体果蝇蛋白水平的鉴定

2.3 稳定遗传的fidgetinM14-2果蝇品系的鉴定得到的纯合fidgetinM14-2果蝇后，通过Western blot检测蛋白的表达水平. 实验中用到野生型和fidgetinM14-2两个基因型果蝇，以actin作为参照，用Fidgetin的抗体检测，实验结果符合预期，如图5，野生型检测出Fidgetin的带，而fidgetinM14-2果蝇没有相对应的带，则表明在fidgetinM14-2果蝇中，无Fidgetin蛋白表达，由此说明我们得到了fidgetin无功能突变体果蝇.

2.4Fidgetin调节神经肌肉突触的发育为了检测fidgetin是否影响神经突触的发育，本实验观察了三龄幼虫的神经肌肉接头(neuromuscular junction, NMJ)，我们用标记神经细胞膜的HRP和标记突触囊泡的CSP进行免疫染色，使用激光共聚焦显微镜拍摄，GraphPad Prism 5.0 软件进行统计和数据分析，统计结果显示野生型的神经突触扣结分布均匀，神经系统敲减了fidgetin(elav-Gal4;UAS-fidgetinRNAi)和fidgetinM14-2突变体果蝇的NMJ扣结数目增加. 我们统计了各个基因型的三龄幼虫的第三体节四号肌肉的NMJ总扣结数目，fidgetinRNAi果蝇扣结数是(37 ± 2.22)个，和野生型(28 ± 0.98)个比较有显著增加(P< 0.01)，fidgetinM14-2突变体果蝇的扣结数目是(39 ± 2.24)个，和野生型(28 ± 0.98)个比较有极显著增加(P< 0.001)，如图6所示.

图6 Fidgetin调节神经肌肉突触的发育 A)将野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2突变体果蝇的三龄幼虫解剖染色，红色标记的是突出 囊泡的CSP，绿色标记的是神经细胞膜的HRP； B)柱状统计图显示的是野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2 突变体果蝇的扣结总数目(样本数n分别为WT：18； fidgetinM14-2：20； fidgetin RNAi：25)

3 讨论

本实验用黑腹果蝇作为模式生物，运用CRISPR/Cas9技术对果蝇的fidgetin基因进行编辑，获得了fidgetin的无功能突变体果蝇fidgetinM14-2. 有研究表明神经网络结构的错误调控会导致果蝇神经肌肉突触发育的异常[21].实验中我们观察到fidgetinRNAi、fidgetinM14-2突变体果蝇表型一致，两者NMJ的扣结数目较野生型数目显著增加. 这个结果和其他微管剪切蛋白Katania 60和Spastin的突变体的NMJ表型不同[22]，katania60突变体总卫星扣结数目增加，spastin的突变体的NMJ的分支数增加，说明3种微管剪切蛋白从不同的方面调节果蝇神经肌肉突触的生长. 此结果也说明fidgetin对果蝇神经肌肉突触的发育是必须的.fidgetinM14-2突变体果蝇的NMJ的扣结数目较野生型数目显著增加，可能会降低信号在NMJ上的传递效率. 另外，Fidgetin在果蝇发育过程中的其他方面的影响还需进一步探讨.