甘蓝型油菜脂肪酸脱氢酶2兔源多克隆抗体的制备与应用

熊 丹， 周 霆， 田方艳， 饶力群， 陈 松， 汪启明

(1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128； 2.湖南远泰生物技术有限公司，湖南 长沙 410000； 3.江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室,江苏 南京 210014)

油脂是人体必需的关键营养素之一，是维持身体机能正常运转的能量来源，更是细胞、组织、脏器的重要组成成分。油菜是仅次于大豆和花生的第三大植物油脂来源[1]，菜籽油含有丰富的油酸、亚油酸、亚麻酸以及维生素E等有效成分，亚油酸、亚麻酸是人自身无法合成的必需脂肪酸，百分之九十九能被人体所吸收[2-3]。适量的补充亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，可软化血管，预防心血管疾病的发生[4]，但是亚油酸和亚麻酸相较于油酸，更容易氧化发生酸败，产生不利于健康的物质[5-6]。如何合理控制各脂肪酸比例构成，提高菜籽油品质，已成为油菜品种改良的重要研究方向。

前期对甘蓝型油菜高油酸品种的基因分析结果表明，其高油酸性状的产生是由于FAD2基因突变导致[7-10]。FAD2基因编码的是一种脂肪酸脱氢酶2(FAD2)，该蛋白质定位于内质网上，催化油酸转化为亚油酸[11-13]。亚油酸又可被脂肪酸脱氢酶3转化为亚麻酸[14]。所以，FAD2是控制油菜高油酸产量，保持脂肪酸稳定性的关键基因，多个油菜品质改良项目曾围绕此基因进行[15-17]。

目前，对于FAD2基因功能改变的检测，主要还是以FAD2酶催化的底物和产物含量的变化为主。即通过气相[18]、液相[19]以及红外光谱[20-21]等手段，检测样本中油酸和亚油酸或亚麻酸含量的变化，从而监测此基因功能是否改变。在利用免疫学方法对蛋白质积累检测方面，由于暂未有商业化的可用于植物FAD2蛋白检测的特异性抗体及其相关制备报道，在前期研究中，主要是用基因工程方法融合其他标签，通过使用标签抗体对融合标签进行检测[13,22]来体现FAD2蛋白表达变化，并不能完全体现内源性FAD2蛋白表达的变化。本研究对甘蓝型油菜FAD2蛋白进行生物信息学分析，通过合成特征性多肽片段免疫动物，获得特异性针对甘蓝型油菜FAD2蛋白的兔源多克隆抗体，为该蛋白质翻译后调控机制的研究提供有利工具。可以用此抗体识别不同品种油菜不同栽培条件下FAD2蛋白表达差异，为后期育种筛选及栽培条件优化以及转基因安全评价方法的简化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要植物材料

甘蓝型油菜品种(Westar)WT和FAD2-RNAi高油酸转基因油菜品系W-4由江苏省农业科学院经济作物研究所提供。

1.2 试验动物

本研究选用的动物为2只雄性新西兰大白兔，购于湖南太平生物科技有限公司。在湖南远泰生物技术有限公司清洁级动物饲养房中饲养，室温维持22 ℃，正常的昼夜频率，一兔一笼。提供充足的饲料和干净的饮用水，试验动物可以自由进食和饮水，维持体质量在2.5～3.5 kg。该动物试验方案得到了湖南远泰生物技术公司动物伦理委员会的批准(依据《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》)。

1.3 主要试剂

HRP labeled anti-IgG、anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody由Promab提供，anti-actin Mouse monoclonal antibody购于CWbio公司，anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody、ECL试剂盒购于CST公司，弗氏完全佐剂以及弗氏不完全佐剂购于Sigma公司，Protein A Sepharose购于GE公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于北京鼎国公司，蛋白质marker购于Thermo Fisher公司，BCA蛋白检测试剂盒购于BioSharp公司。

研磨缓冲液(0.240 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.060 mol/L KCl, 0.250 mol/L蔗糖, 0.024 mol/L MgCl2)，内质网分离缓冲液(0.040 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.010 mol/L KCl, 0.040 mol/L MgCl2, 0.005 mol/L EDTA)，储存于4 ℃条件下，使用前加入0.006 mol/L DTT, 0.006 mol/L PMSF。

1.4 抗原确定与合成

在UniProtKB数据库中搜索关键词：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息。

采用ABCpred Prediction Server在线软件[23]分析BnFAD2(UniProtKB：C3W518)氨基酸B细胞抗原表位，将预测表位阵列得分超过0.9的序列，输入NCBI数据库中，与油菜蛋白质库进行氨基酸序列比对，验证氨基酸表位序列的特异性。选取得分以及特异性最高的2条多肽序列(PA和PB)，于杭州中肽生化有限公司进行多肽合成，并将合成好的多肽分别偶联到KLH和BSA上。

1.5 BnFAD2兔源多克隆抗体的制备

1.5.1 动物免疫 初次免疫前，兔耳静脉采血作为免疫阴性对照血清。BnFAD2-PA-KLH多肽与BnFAD2-PB-KLH多肽冻干粉溶解后，各取50 mg混合均匀，再与等体积弗氏完全佐剂按比例混合，多点皮下注射新西兰大白兔。21 d后，混合抗原量减半与弗氏不完全佐剂混合，进行第二次免疫。以此方式每隔14 d，进行第三以及第四次免疫。4次免疫后7 d，兔耳静脉采血，常温下3 000 r/min离心20 min，取血清，用于后续检测。

1.5.2 免疫酶联法检测免疫血清 酶标板中抗原BnFAD2-PA-BSA以及BnFAD2-PB-BSA的包被量为每孔0.2 μg。以免疫前血清为阴性对照，以1∶5 000稀释HRP labeled anti-IgG作为二抗，检测不同稀释度的免疫兔血清，TMB显色终止后，在酶标仪上读取吸光度值(OD450)。

1.5.3 BnFAD2兔源多克隆抗体的纯化 收集全兔血，离心分离血清。按照说明书所述方法，将血清进行Protein A Sepharose亲和层析纯化，获得BnFAD2兔源多克隆抗体。用SDS-PAGE凝胶法鉴定该兔多抗的蛋白质分子量大小与纯度，BCA法鉴定其浓度。

1.6 甘蓝型油菜品种W-4不同世代FAD2蛋白表达的鉴定

1.6.1 油菜样本总蛋白质的提取 取一定体积的样品(WT、W-4的T3代,W-4的T7代植株开花21 d后的果荚以及成熟期叶片)，液氮研磨成粉末状后，参照文献[24]、[25]，研磨缓冲液匀浆,经2次2 000g离心5 min后，取2 ml上清液样品留样，其余上清液加入到含有5 ml 50%蔗糖溶液的超离心管中，100 000g离心20 min，收集总膜层(50%蔗糖溶液与匀浆上清液之间)，等体积混合内质网分离缓冲液，采用蔗糖梯度(7 ml 15% 蔗糖溶液，12 ml 35% 蔗糖溶液和5 ml 40% 蔗糖溶液)100 000g离心30 min，收集粗面内质网膜组分(35% 蔗糖与40% 蔗糖溶液之间)，加入3倍体积内质网分离缓冲液，100 000g离心30 min，沉淀用少量预冷的内质网分离缓冲液重悬，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存。所有离心均在4 ℃进行。

1.6.2 SDS-PAGE分离蛋白质 根据SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司产品)说明书配制分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%的SDS-PAGE凝胶。将样本分果荚总蛋白质、叶片总蛋白质、内质网蛋白质3个组别，每个组别经BCA法进行蛋白质定量后，统一上样量，用Mini-PROTEAN© Tetra(Bio-Rad)系统进行凝胶电泳。

1.6.3 Western Blotting法鉴定甘蓝型油菜同世代 FAD2蛋白表达 样品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至NC膜上。经5%的脱脂奶封闭1 h，一抗(anti-BnFAD2 Rabbit Polyclonal antibody，稀释比为1∶1 000，anti-actin Mouse monoclonal antibody，稀释比为1∶2 500)孵育过夜，用PBST缓冲溶液进行洗膜后加入对应的二抗(anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody,稀释比为1∶30 000，anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody，稀释比为1∶10 000)，室温孵育2 h，洗膜后，使用ECL试剂盒进行显影。

2 结果与分析

2.1 油菜FAD2抗原表位预测和鉴定

在UniProtKB数据库中搜索关键词：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息，其UniProtKB序列号为C3W518，定位在内质网上(图1A)，是由384个氨基酸组成的4次跨膜结构蛋白质(如图1B所示)。ABCpred在线系统对该氨基酸序列进行B细胞表面抗原表位预测，肽的较高得分意味着有较高的概率作为表位。方框中氨基酸部分为此抗原表位预测分数超过0.9的区域(图1 C)。参考预测结果和蛋白质细胞亚定位的特点，我们选择位于细胞质结构中并且预测分数较高的区域，在NCBI数据库中对油菜蛋白质氨基酸序列进行比对，最后选择PA:VSPPSKKSETDTIKR(9～23 aa)以及PB:SHRRHHSNTGSLERD(140～154 aa)2条多肽为免疫抗原表位(命名及区域氨基酸序列如图1 B下划线部分所示)。

A:BnFAD2蛋白的亚细胞定位(图片来源于UniProtKB数据库);B:BnFAD2蛋白跨膜结构简图与抗原肽段选择位点;C:ABCpred在线系统对BnFAD2 B细胞表面抗原表位的预测结果。划横线的表示合成多肽的氨基酸序列；方框里表示抗原表位预测分数超过0.9的区域。图1 BnFAD2抗原表位预测Fig.1 Epitopes prediction of BnFAD2

用质谱法(Mass spectrum, MS)进行多肽鉴定。结果如图2显示，BnFAD2-PA的相对分子质量为1 776，BnFAD2-PB的相对分子质量为1 892，2条多肽测定的相对分子质量与理论值相符。

图2 BnFAD2多肽质谱鉴定结果Fig.2 Identification of BnFAD2 polypeptide by mass spectrometry

用高效液相法(High performance liquid chromatography, HPLC)对2条合成的多肽进行纯度分析(图3)，BnFAD2-PA的纯度为80.19%，BnFAD2-PB的纯度为96.24%(表1)。

图3 BnFAD2多肽的高效液相分析结果Fig.3 Identification of BnFAD2 polypeptide by high performance liquid chromatography

表1 BnFAD2-PA以及BnFAD2-PB纯度分析

2.2 BnFAD2兔源多克隆抗体的获得

将第四次免疫后第7 d采集的兔血清进行ELISA试验，鉴定免疫效果。如图4所示，1号兔和2号兔免疫抗原后，对BnFAD2-PA与BnFAD2-PB多肽都产生了免疫反应。1号兔免疫反应高于2号兔。

取全血进行Protein A Sepharose亲和层析，所得到的蛋白质溶液10倍稀释后进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，如图5所示，在非变性条件下，该抗体在大于150 000处有条带，与完整抗体分子条带相符，变性条件下，在50 000以及25 000左右有两条带，即抗体重链和轻链。此蛋白质大小与抗体大小相符，抗体结构完整。BCA法定量得到稀释后该抗体质量浓度为0.57 mg/ml，获得的抗体总产品质量浓度为5.7 mg/ml。

A:包被抗原为BnFAD2-PA-BSA;B:包被抗原为BnFAD2-PB-BSA。图4 BnFAD2多肽的免疫效果鉴定Fig.4 Immune effect identification of BnFAD2 polypeptide

M1: PageRuler预染蛋白质相对分子质量标准(Thermo); M2:Pierce非预染蛋白质相对分子质量标准(Thermo); 1:anti-BnFAD2纯化后10倍稀释样本经原性上样缓冲液处理; 2：anti-BnFAD2纯化后10倍稀释样本经非还原性上样缓冲液处理 。图5 BnFAD2兔源多克隆抗体的SDS-PAGE鉴定Fig.5 Identification of anti-BnFAD2 rabbit-derived polyclonal antibody by SDS-PAGE

2.3 甘蓝型油菜品种W-4不同世代FAD2蛋白表达鉴定

果荚总蛋白质、叶片总蛋白质以及内质网蛋白质通过BCA法测定每个样本浓度后，样本的上样量总蛋白质为每孔2 μg，内质网蛋白质为每孔1 μg，进行FAD2蛋白的Western blotting检测。其结果如图6所示，WT、W-4-T3代、W-4-T7代果荚以及WT、W-4-T3代、W-4-T7代成熟叶片的总蛋白质以及内质网蛋白质均能在95 000左右检测到条带，WT条带最高，而W-4-T7代最弱。叶片中，3个样本差异不明显。

3 讨 论

A图中抗原为果荚总蛋白。1，4，7为W-4-T7代；2，5，8为W-4-T3代；3，6，9为WT；B图中抗原为叶片总蛋白。1，4，7为W-4-T7代；2，5，8为W-4-T3代；3，6，9为WT；A，B图中，1，2，3：一抗为anti-BnFAD2；4，5，6：一抗为anti-actin；7，8，9：一抗为免疫前兔血清;依据一抗种属选择相应二抗;C图抗原，1，2，3：果荚内质网蛋白，样本依次为WT、W-4-T3代、W-4-T7代。4，5，6：叶片内质网蛋白，样本依次为WT，W-4-T3代，W-4-T7代。一抗为anti-BnFAD2，二抗为anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody。图6 甘蓝型油菜品种W-4不同世代中FAD2蛋白表达鉴定Fig.6 Identification of FAD2 protein expression in different generations of Brassica napus cultivar W-4

抗体作为哺乳动物被动免疫应答的产物，其对抗原的特异性识别功能已被研究者们成功应用到基因表达水平变化的检测中。目前，哺乳动物蛋白质检测抗体的种类齐全，免疫学检测方法应用较广泛。植物在与生物胁迫以及非生物胁迫对抗的漫长进化过程中，造成了植物蛋白质编码基因的多样性以及蛋白质翻译后的修饰非常复杂。因此与哺乳动物抗体相比，对其特异性抗体的开发和免疫学方法的应用研究步伐较缓慢。特异性抗体的获得，其免疫抗原的品质很关键。目前多采用体外表达重组蛋白质的方式来获得高品质抗原[26]。重组全长蛋白质可以提供足够的特征性抗原表位，用其免疫获得的多克隆抗体，具有多种表位识别能力，可以更准确地捕获天然裂解液中的微量抗原蛋白质。而重组全长蛋白质的获得，受到多种因素的制约，如蛋白质本身的结构特征、蛋白质的大小及其等电点、疏水性等。FAD2是定位于内质网上的膜蛋白，预测相对分子质量大小为44 171，具有4个跨膜区。利用原核表达系统得到其重组蛋白质的难度较大。利用合成生物学，体外合成特征性多肽，再将其偶联到具有强免疫原性的大分子上，可以解决免疫抗原的获得问题[27-28]。而多个肽段的混合免疫，使免疫得到的多克隆抗体尽可能多地拥有多个表位的识别，提高抗体对微量抗原的识别能力。

本研究中利用生物信息学分析，获得油菜BnFAD2蛋白高抗原性多肽序列，经多肽合成后，混合免疫动物获得抗体。BnFAD2-PA肽段位于跨膜导肽与第一跨膜区之间，是多种植物FAD2的共有序列，BnFAD2-PB肽段位于胞质区域，是油菜FAD2的特异性序列。因此，混合免疫得到的兔源多克隆抗体，对于油菜FAD2有2个表面抗原识别位点，也可以利用其对植物FAD2共有序列的识别能力，应用到其他植物FAD2的检测鉴定中。

FAD2是将油酸转化为亚油酸的关键酶，而FAD3是将亚油酸转化为亚麻酸的关键酶，这两个酶同时位于细胞内质网上，在脂肪酸代谢途径中属于递呈关系。有研究结果表明，拟南芥原生质体中，当FAD2和FAD3维持酶活性行使功能时，多以同源二聚体以及异源二聚体的形式存在[22]，其二聚体的比例与产物中亚油酸和亚麻酸的比例有直接关系。前期研究结果表明，FAD2在油菜开花后21 d含量达到最高，成熟期叶片维持一致[29]。W-4转基因油菜与以往外源导入某种基因来增加或减弱相应蛋白质表达的方法不同，其是在导入含种子特异性启动子的FAD2某段序列，利用RNAi的方法，有效抑制种子中FAD2的转录[30]。本研究中，采用野生型甘蓝型油菜品种WT以及RNAi干扰转基因型油菜品种W-4为试验材料，提取其果荚和叶片中的总蛋白质，分离收集其内质网蛋白质成分，BnFAD2兔源多克隆抗体均能在免疫印迹反应中检测到相应物质。果荚样本中，Western blotting的结果显示W-4的不同世代样本FAD2蛋白表达较WT均呈现下降。在成熟叶片样本中，W-4的不同世代样本FAD2蛋白表达基本维持一致，提示该RNAi干扰载体中引入的种子特异性启动子元件，组织特异性作用效果明显。RNAi干扰转基因型油菜品种W-4的FAD2组织特异性表达抑制效果，通过该BnFAD2兔源多克隆抗体得到蛋白质水平上的内源性验证，为相关转基因油菜品种提供了FAD2蛋白表达的检测抗体。此外，免疫印迹检测中，阳性条带的位置与前期体外研究结果相符[22]，首次验证内源性油菜FAD2同样以多聚体的形式在细胞内质网上行使功能，而其多聚体的组合方式及其相应生理功能的调控机制，还需要进一步试验验证。