非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP检测方法的建立与应用

王林，高晓龙，吴迪，张玮，张启龙，栗云鹏，程汝佳，杜鹃，李蕊，王培， 冯小宇，韦海涛，周德刚，刘晓冬，宋彦军

(北京市动物疫病预防控制中心，北京102629)

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种高度接触性的烈性传染病，致死率几乎100%，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告传染病。自1921年肯尼亚首次发生非洲猪瘟疫情以来，该病给全球养猪业造成严重威胁和巨大经济损失。上世纪中叶非洲猪瘟通过航空运输传入欧洲，相继在意大利、葡萄牙、法国、比利时、荷兰等国家暴发疫情，经过二三十年的努力，除意大利撒丁岛外，欧洲其他国家成功将该病根除；但2007年，格鲁吉亚暴发非洲猪瘟疫情后，该病持续向全球蔓延，在俄罗斯、白俄罗斯、波兰等东欧国家和地区广泛流行[1]。我国自2018年10月发生首例非洲猪瘟疫情以来[2]，迅速蔓延全国31个省份，截至2019年10月全国共报告158起非洲猪瘟疫情，共扑杀生猪百万余头，导致我国生猪养殖遭受毁灭性打击，甚至给我国经济、政治、社会带来严重的影响。鉴于当前无有效商品化疫苗可用[3]，因此非洲猪瘟的早期快速准确诊断对该病的防控具有非常重要的意义。

国内外研究人员针对非洲猪瘟病毒建立了多种核酸检测方法[4]，主要有PCR、荧光定量PCR、数字PCR[5]、恒温RPA-LFD[6]以及纳米孔测序[7]等，但这些方法存在检测时间长、操作繁琐、设备要求高、成本高、易污染等问题。虽然恒温RPA-LFD检测方法反应时间仅为20 min，但其利用免疫层析试纸条进行结果判读仍需10～15min，操作繁琐同样不利于非洲猪瘟的现场快速诊断，而环介导等温快速检测方法(Loopmediated Isothermal Amplification, LAMP)具有特异性好、灵敏度高、操作方便等优点[8-9]，且多位研究人员也针对口蹄疫[10]、禽流感[11]、圆环3型[12]、中东呼吸综合征病毒[13]以及西尼罗河病毒[14]等多种疾病建立了LAMP恒温快速检测方法。

因此，本研究基于LAMP扩增技术针对ASFV p72基因保守区域设计特异性引物组建立ASFV恒温快速检测方法，并通过向LAMP反应体系中添加SYTO9荧光染料实现对扩增反应的实时监控和结果判定，同时对该方法的灵敏度、特异性、重复性、符合率和适用仪器等进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂 便携式MA-1610型等温荧光PCR仪(购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司)、ABI QuantStudio 7荧光定量PCR仪、LoopampDNA 扩增试剂盒(购自荣研生物科技(中国)有限公司)、SYTO9(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、DNA核酸提取试剂盒(购自杭州博日科技有限公司)

1.1.2 毒株与样品 非洲猪瘟病毒p72基因保守区域DNA质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

非洲猪瘟阳性样本核酸、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-JXA1株)、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-LV株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)等均由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据Genbank已发表的ASFV Georgia株(GenBank: MH910495.1)，运用“环介导等温扩增法引物设计辅助软件(http:∥primerexplorer.jp/)在线设计非洲猪瘟病毒p72基因的内引物、外引物和环引物，引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 引物筛选 将人工合成的ASFV p72基因保守区域DNA质粒稀释成浓度为1×104copies/μL和无RNase水作为阳性模板和阴性模板，63℃扩增120 min，根据阳性反应时间、“S型”扩增曲线和非特异性曲线等结果综合分析，筛选ASFV实时荧光LAMP快速检测方法的最佳引物组。

表1 基于ASFV p72基因设计的LAMP扩增引物Tab 1 LAMP Primers designed for the P72 gene of ASFV

1.2.3 方法的建立与优化 按照LoopampDNA 扩增试剂盒说明书进行配制ASFV荧光LAMP基础反应体系18.5 μL，包含2×LAMP反应液 12.5 μL，外引物(F3/B3，浓度为5 μM)各1μL、内引物(FIP/BIP，浓度为40 μM)各1μL、环引物LB(浓度为20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9荧光染料(1 mM)1 μL，DNA模板2 μL，无DNA酶水补足至25 μL。反应条件为63℃，1 min，50cycles。

以浓度为1×105copies/μL 的DNA质粒为模板，分别在61℃、63℃、65℃、67℃ 等4个温度条件下进行扩增，根据阳性反应时间确定最佳反应温度。

分别以浓度为1×106～1×101copies/μL 的p72基因质粒为模板，在最佳反应温度时进行扩增，根据最低检测限来确定最佳反应时间。

1.2.4 灵敏度验证 将浓度为1×106copies/μL 的p72基因质粒进行10倍系列稀释，稀释至1×100copies/μL同时进行实时荧光LAMP检测，每个浓度做3个重复，验证该方法灵敏性。

1.2.5 特异性验证 将本实验室保存的ASFV核酸(经实验室检测不含PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、FMDV、PCV2和PCV3等病毒核酸)和PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV提取核酸后进行实时荧光LAMP检测，验证该方法的特异性。

1.2.6 重复性验证 分别以浓度为1×105～1×101copies/μL的p72基因质粒为模板，进行实时荧光LAMP扩增，每个稀释度重复4次，根据其Ct值计算变异系数，评价该方法的重复性。

1.2.7 仪器适用性验证 使用浓度为1×106～1×101copies/μL的p72基因质粒为模板，分别在ABI QuantStudio 7荧光定量PCR仪和便携式MA-1610型等温荧光PCR仪进行实时荧光LAMP扩增，对本方法适用仪器进行验证。

1.2.8 临床样本检测 分别采用本研究建立的ASFV实时荧光LAMP快速检测方法和《非洲猪瘟病毒检测操作规程(试行)》“非洲猪瘟核酸检测技术(方法一)”规定的实时荧光PCR检测方法，对本实验室采集的20份饲料、30份血液、20份脾脏等70份样品进行检测，分析该方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 引物筛选 分别使用设计的ASFV-LAMP扩增引物组A和B对1×105copies/μL DNA合成质粒和阴性对照63℃扩增2h。结果(图1)显示，A组引物在29 min出现明显的“S”型扩增曲线且阴性对照无非特异性扩增，而B组引物在75 min才检出阳性DNA模板，A组引物阳性检出时间优于B组，因此选择A组引物为ASFV实时荧光LAMP检测引物。

图1 ASFV实时荧光 LAMP引物筛选Fig 1 Primers screening of real-time fluorescent LAMP for ASFV

2.2 方法的建立与优化 经优化后的ASFV实时荧光LAMP快速检测方法反应体系为25 μL，分别为2×LAMP反应液 12.5 μL，外引物(F3/B3，浓度为5 μM)各1 μL、内引物(FIP/BIP，浓度为40 μM)各1 μL、环引物LB(浓度为20 μM)1 μL、Bst DNA 聚合酶1 μL，SYTO9荧光染料(1mM)1 μL，DNA模板2 μL，无DNA酶水3.5 μL。

最佳反应温度优化结果(图2)显示，61℃时Ct值为21.89，63℃时Ct值为19.57，65℃时Ct值为21.06，67℃时Ct值为25.75，表明同一模板浓度条件下，63℃扩增时间最短，因此最佳反应温度为63℃。

图2 反应温度优化Fig 2 Optimization of reaction temperature

2.3 灵敏度及最佳反应时间 以1×106～1×100copies/μL 的p72基因质粒为模板进行实时荧光LAMP扩增。结果(图3)显示，ASFV实时荧光LAMP检测方法最低检测限为10 copies/μL。ASFV实时荧光LAMP标准曲线(图4)表明该检测方法结果Ct值与模板浓度呈线性相关，R2为0.992，表明线性关系良好。

由图3可知，本方法最低检测限为10 copies/μL，重复3次的平均Ct值为30.21，因此本方法最佳反应循环数为40 cycles，即最佳反应时间为40 min。

1～7: 1×106 ～1×100 copies/μL图3 ASFV实时荧光LAMP灵敏度验证Fig 3 Sensitivity of ASFV real-time fluorescent LAMP

图4 ASFV实时荧光 LAMP标准曲线Fig 4 Standard curve of ASFV real-time fluorescent LAMP

2.4 特异性验证 采用ASFV、PRV、CSFV、PRRSV-JXA1株、PRRSV-LV株、PEDV进行实时荧光LAMP扩增，验证其特异性。结果(图5)显示，除ASFV出现特异性扩增外，其余病毒检测均为阴性，表明该方法特异性良好。

2.5 重复性验证 采用1×105～1×101copies/μL的p72基因质粒为模板进行实时荧光LAMP扩增，每个稀释度重复4次，结果如表2所示，变异系数均小于5%，说明该方法重复性良好。

2.6 适用仪器验证 利用ASFV实时荧光LAMP方法分别在ABI QuantStudio 7荧光定量PCR仪和便携式MA-1610型等温荧光PCR仪上对1×106～1×101copies/μL浓度的质粒模板进行扩增，结果(图6)显示，全部浓度的质粒均能检出，表明本方法仪器适用性好，既可适用于兽医诊断实验室常用的荧光定量PCR仪，也能适用于便携式恒温荧光PCR仪。

图5 ASFV实时荧光LAMP特异性验证Fig 5 Specificity of ASFV real-time fluorescent LAMP

表2 ASFV实时荧光LAMP重复性验证Tab 2 Repeatability of ASFV real-time fluorescent LAMP

A：便携式MA-1610型等温荧光PCR仪；B：ABI QuantStudio 7荧光定量PCR仪； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7：阴性对照 A: Portable isothermal fluorescence PCR(MA-1610)； B: ABI QuantStudio 7； 1～6：1×106 ～1×101 copies/μL；7: Negative control图6 ASFV实时荧光LAMP方法不同仪器适用性验证Fig 6 Verification for the applicability of ASFV real- time fluorescent LAMP in different PCR instruments

2.7 临床样品检测 采用本研究建立的ASFV实时荧光LAMP方法和标准方法qPCR同时对70份临床样品进行ASFV检测。结果(表3)显示，LAMP方法检测出4份血液样品、9份脾脏样品检测阳性，其余样品均为阴性，与标准方法qPCR检测结果一致，符合率为100%。

表3 实时荧光LAMP和qPCR临床样品检测结果Tab 3 Parallel test results between real-time fluorescent LAMP and qPCR for clinical samples

3 讨论与结论

自2018年10月我国暴发首例非洲猪瘟疫情以来，迅速蔓延至全国，给我国生猪养殖造成非常严重的损失。因此非洲猪瘟的现场快速诊断对于该病的发现、传播和控制具有重要的意义。LAMP恒温快速检测技术能够针对保守区域设计4-6对引物，在60～65 ℃恒温条件下40～60 min即可完成检测，具有方便、快捷、准确等优点，广泛用于细菌、寄生虫、病毒的现场快速检测。目前LAMP检测结果的判定主要有浊度法、钙黄绿素目视法、琼脂糖凝胶电泳法以及免疫层析法等，但浊度法对仪器设备要求高、钙黄绿素目视法对弱阳样品存在人为误判且成本高、琼脂糖凝胶电泳和免疫层析反应管开盖极易造成环境污染，造成LAMP检测技术难以在临床应用推广。Than Linh Quyen等研究发现SYTO9作为一种激发波长和发射波长与FAM相近的DNA荧光染料(激发波长为485 nm、发射波长为498 nm)，其具有信噪比高、灵敏度高、对扩增反应无抑制作用等优点，可用于LAMP扩增反应过程中的实时监控，有助于提高LAMP检测的准确性以及减少气溶胶污染[15]。

因此，本研究针对非洲猪瘟病毒P72基因保守区域设计特异性LAMP检测引物，包括2条内引物、2条外引物和1条环引物，并对反应温度、时间等反应条件进行优化，同时通过在反应体系中添加适量的SYTO9荧光染料，建立了非洲猪瘟病毒SYTO9实时荧光LAMP快速检测方法。本方法反应时间短，在63 ℃恒温条件下反应40 min即可完成扩增反应，最快15～20min就能检测到ASFV；灵敏度高，最低检测限为10 copies/μL；特异性良好，PRV、CSFV、PRRSV、PEDV等病毒不发生非特异性扩增；重复性好，变异系数均小于5%，；符合率高，与农业农村部推荐的荧光定量PCR方法符合率为100%;适用仪器较广，不仅适用于等温荧光PCR仪，同时也适用于各种常规荧光定量PCR仪器。

综上所述，本研究建立的基于SYTO9荧光染料的非洲猪瘟病毒实时荧光LAMP快速检测方法具有反应快速(40 min)、灵敏度高、特异性强、重复性好、符合率高、操作简便、不易污染、适用仪器广等优势，可用于非洲猪瘟现场快速鉴别诊断，为非洲猪瘟现场应急检测和防控提供了一种新方法，更适合基层推广应用。