超高效液相色谱-串联质谱法同时测定红曲类保健食品中美伐他汀和去羟基洛伐他汀

严俊　颜琳琦　胡磊　陈岑　徐柏杨　周明昊

摘要 [目的]建立了同时检测红曲类保健食品中美伐他汀、去羟基洛伐他汀的超高效液相色谱-串联质谱法。[方法]样品经甲醇超声提取，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸/水溶液（75∶25），流速0.2 mL/min，以电喷雾离子源正离子多反应模式（MRM）进行检测。[结果]2种目标物在4 min内得到良好分离。美伐他汀和去羟基洛伐他汀分别在6.1～606.6和4.8～483.5 ng/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=1），低、中、高3个添加水平的回收率在97%～105%，RSD<3.0%，检出限分别为17、15 μg/kg。[结论]该方法简单、快速、灵敏、准确，可用于红曲类保健食品中美伐他汀和去羟基洛伐他汀的同时检测。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱法;美伐他汀;去羟基洛伐他汀;红曲类保健食品;同时测定

中图分类号 TS 207.3文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）16-0192-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.054

Simultaneous Determination of Mevastatin and Dehydro Lovastatin in Monascus Kinds of Health Food by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

YAN Jun， YAN Lin-qi， HU Lei et al

（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou， Zhejiang 310000）

Abstract [Objective] To establish a method for simultaneous determination of mevastatin and dehydro lovastatin in monascus kinds of health food based on ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Method] The samples were extracted by methanol. With acetonitrile and 0.1 % formic acid （75∶25） as mobile phase at a flow rate of 0.2 mL/min， the determination was conducted on Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm） column by tandem mass spectrometry in positive ESI mode under multiple reaction monitoring （MRM） mode. [Result] The two targets were well separated within 4 min. The calibration curve of mevastatin and dehydro lovastatin was linear in the concentration range of 6.1-606.6 and 4.8-483.5 ng/mL （r=1）， respectively. The average recovery were in range of 97%-105% at low， modern and high added levels， while RSD was less than 3.0%. The limit of detection were 17， 15 μg/kg， respectively. [Conclusion] The method is convenient， rapid， sensitive and accurate， which is suitable for simultaneous detection of mevastatin and dehydro lovastatin in monascus kinds of health food.

Key words Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Mevastatin;Dehydro lovastatin;Monascus health foods;Simultaneous determination

作者简介 严俊（1989—），男，安徽马鞍山人，主管药师，硕士，从事保健食品和化妆品理化检验研究。*通信作者，主任药师，硕士，从事保健食品、化妆品理化检验研究。

收稿日期 2020-02-24

红曲是由红曲菌科真菌红曲菌的菌丝体寄生在大米上发酵而成[1]，在我国有着悠久的生产和使用历史，已被廣泛应用于食品、医药领域[2-3]。红曲在生长过程中产生的多种生理活性物质，具有降血脂[4]、调节免疫[5]、抗微生物活性[6]、降低胆固醇[7]、抗肿瘤[8]等作用。伴随着经济的飞速发展，人们生活水平的不断提高，加上饮食以及运动的不合理，高脂血症人群呈逐年增长趋势。自红曲次级代谢产物中发现洛伐他汀及类似物，并证实其对胆固醇合成限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）具有较强的抑制能力，可以显著降低血脂水平后[9-10]，以红曲为原料的保健食品开发受到市场的广泛关注。

美伐他汀及去羟基洛伐他汀是洛伐他汀类似物，结构上与洛伐他汀分别相差1个-CH2基团和1个H2O分子，对HMG-CoA都具有抑制作用，可以降低体内血脂水平[11-12]。目前关于洛伐他汀的检测方法较多，主要为高效液相色谱法[13]、液质联用法[14-15]，但涉及到红曲类保健食品中美伐他汀和去羟基洛伐他汀同时检测的报道较少，存在被非法添加到降血脂类保健食品中的风险。为此，笔者基于超高效液相色谱-串联质谱构建了一种快速、灵敏、准确的检测方法，实现了同时定性和定量检测红曲类保健食品中美伐他汀、去羟基洛伐他汀。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器。

1290-G6490三重四极杆质谱仪;XPE 205 型电子天平;KQ-300DB超声波清洗器;Gen pure UV/UF 超纯水仪。

1.1.2

试剂。甲醇、甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵均为色谱纯，试验用水均为纯化水，6批样品均为浙江省食品药品检验研究院国家及省级抽检样品，以欣源片作为方法学研究对象。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制。

精密称取美伐他汀24.76 mg，去羟基洛伐他汀对照品9.67 mg，分别置20、10 mL容量瓶中，用甲醇制成对照品单标储备液;分别移取美伐他汀单标储备液2.0 mL 及去羟基洛伐他汀单标储备液1.0 mL置20 mL容量瓶中加甲醇定容，得浓度为48.35 μg/mL混合对照溶液（以去羟基洛伐他汀计）。分别移取上述混合对照溶液0.1 mL置10、25、50、100 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至刻度，制备成483.5、193.4、96.7、48.4 ng/mL的系列混合标准溶液;分别移取48.4、96.7 ng/mL混合标准溶液各1.0 mL置10 mL容量瓶中，用空白基质溶液稀释至刻度，制备成4.8、9.7 ng/mL的系列混合标准溶液（以去羟基洛伐他汀计）。

1.2.2 样品溶液的提取。

将片剂10片研细、混匀，取约0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，加甲醇适量，超声（37 kHz）20 min后放冷，全部转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀;取1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜即得。

1.2.3 仪器条件。

1.2.3.1

色谱。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;流速0.2 mL/min;柱温：35 ℃;进样量0.5 μL;流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸/水溶液;等度洗脱A-B（75∶25）;采集时间：4 min。

1.2.3.2

质谱。离子源为电喷雾（ESI）离子源，正离子电离模式;干燥气（N2）温度350 ℃;干燥气流量10 L/min;鞘气流速：11 L/min;源电压：3.0 kV;检测方式：多重反应监测（MRM）模式。各成分的质谱分析参数见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱行为

在该试验条件下，美伐他汀和去羟基洛伐他汀完全分离，峰型较好，且空白样品（欣源片的空白基质）不干扰测定，结果见图1。

2.2 试验条件的优化

2.2.1 色谱条件的确定。为了使目标化合物快速分离，选择3种色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。结果显示：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱对于目标物分离效果较为理想。笔者选取了甲醇、乙腈作为有机相，水相为0.1%甲酸、0.1%乙酸、10 mmol/L甲酸铵、10 mmol/L乙酸铵。以甲醇为有机相，优化比较水相（0.1%甲酸、0.1%乙酸、10 mmol/L甲酸铵、10 mmol/L乙酸铵），结果发现：0.1%甲酸对目标物响应最高;比较了有机相（甲醇、乙腈），发现乙腈-0.1%甲酸/水溶液體系下，目标物分离良好，分析时间短，且各物质灵敏度高;此外在等度洗脱条件下即可实现目标物的分离。因此，该试验采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，以乙腈-0.1%甲酸/水溶液为流动相进行等度洗脱。

2.2.2 质谱条件的选择。根据美伐他汀和去羟基洛伐他汀的化学结构，通过全扫模式，确定目标物的母离子质量数，再分别对其进行碰撞诱导解离，进而获得2次裂解产生的子离子，然后选择离子丰度高、基线噪音低的2对离子作为定量离子和定性离子，从而得到MRM 离子对及质谱采集参数。对母离子 391.2分别施加15.0、18.0、20.0、25.0 eV的碰撞能，母离子387.3分别施加 5.0、10.0、15.0、20.0 eV的碰撞能，2种母离子分别在 18.0、10.0 eV 碰撞能下，定量离子获得最大响应，为最优碰撞能。同时确定了定性离子158.9和 173.1在20.0 eV 碰撞能下响应最佳，最后优化的参数见表1。

2.2.3 提取溶剂及超声时间的选择。考察了以甲醇、乙醇、乙腈以及流动相（乙腈∶0.1%甲酸/水溶液=75∶25）作为溶剂的提取效果，比较发现甲醇的提取效果明显优于其他3种提取溶剂;同时也对超声（37 kHz）提取时间（10、15、20、25、30 min）进行比较，当超声时间达到20 min后，提取效果趋于饱和。综合考虑提取效率及成本因素，最终选择甲醇为提取溶剂，超声提取时间为20 min。

2.2.4 基质效应。基于超高效液相色谱-串联质谱法测定成分复杂样品时，基质通常对目标物的离子化会产生增强或抑制效应，即为基质效应。为了考察基质对目标物的响应是增强还是抑制，笔者以单标储备液配制成混合标准溶液以及不同空白基质（欣源片剂、鱼油胶囊、大豆卵磷脂胶囊）溶液配制成的混合标准溶液进行比较，其中美伐他汀和去羟基洛伐他汀浓度分别为242.6、193.4 ng/mL，结果表明：在2种目标物的基质效应均为抑制，在不同空白基质（欣源片剂、鱼油胶囊、大豆卵磷脂胶囊）中美伐他汀和去羟基洛伐他汀的基质效应分别为10%～13%、11%～15%、15%～18%。因此，笔者采用了空白基质（欣源片剂）稀释制成混合标准溶液进行校正，以确保检测结果的准确性。

2.3 方法学验证

2.3.1

线性范围和检出限。以空白基质配制基质曲线，以美伐他汀、去羟基洛伐他汀的定量离子峰面积（y）为纵坐标，对照品质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。当样品取样量为 0.5 g，定容体积为500 mL，分别以信噪比（S/N）为3、10确定方法的检出限（LOQ）及定量限（LOD），具体参数见表2。

2.3.2 精密度和重复性。

取美伐他汀、去羟基洛伐他汀混合对照溶液，连续进样6次，结果美伐他汀、去羟基洛伐他汀定量离子峰面积的RSD分别为2.2%、2.5%，表明仪器的精密度满足试验要求。制备6份样品溶液进样分析，结果去羟基洛伐他汀的平均含量为105.9 mg/kg，RSD为0.8%，未检出美伐他汀，表明该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性。

取样品1份，约0.5 g，精密称定，加入约100 μg/mL 混合对照溶液0.5 mL，分别于0、3、6、12、18、24 h记录美伐他汀、去羟基洛伐他汀定量离子峰面积，结果美伐他汀、去羟基洛伐他汀峰面积RSD分别为2.1%、2.4%，结果表明目标化合物24 h内稳定。

2.3.4 加标回收率。

称取样品共9份，每份约0.5 g，分别加入适量的混合对照品溶液，得低、中、高3个不同浓度水平，平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果发现：美伐他汀、去羟基洛伐他汀在3种不同添加浓度下的回收率为97%～105%，RSD<3.0%，表明该方法回收率良好（表3）。

2.3.5 实际样品测定。采用该法对实验室收集的6批样品进行目标物检测，结果均未检出美伐他汀，均检出去羟基洛伐他汀且含量在105.6～380.7 mg/kg浓度范围内，表明红曲在发酵产生洛伐他汀过程中，容易脱去一个羟基产生去羟基洛伐他汀。

3 结论

基于超高效液相色谱-串联质谱建立了一种红曲类保健食品中美伐他汀及去羟基洛伐他汀快速同时检测方法，并对收集的样品进行了检测，结果表明：该法具有简单、快速、灵敏、准确等优点。该方法的建立可为红曲类保健食品中的美伐他汀和去羟基洛伐他汀的检测提供参考，同时可为监管红曲类保健食品中非法添加化学药物提供技术支持。

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