联用大黄、黄芩对牙周炎SD大鼠炎性因子的抑制作用及对骨组织再生的促进效应研究

谷冬华，郭 宁，赵晓丹，刘 瑾，李 昂，苟建重

牙周炎可引起牙龈炎症、牙槽骨吸收，最终导致牙齿的松动和脱落，是造成成年人牙齿丧失的主要原因[1]。而口腔内的细菌菌斑作为牙周炎发病的始动因子，可诱发早期的炎症反应过程，宿主的防御反应会进一步促进牙周结缔组织的破坏和牙槽骨吸收[2-3]。在防治牙周炎的药物研究中，中药以其不良反应小、多靶点受到关注；中药配方以辨证为前提，致病机制为关键，药物的药理特性为基础，遵循“君臣左使”的原则进行配伍，达到减毒增效的作用。大黄作为常用的寒下药，适应证广、疗效明确、毒副作用小而被广泛用于多种疾病的治疗，已有研究发现大黄提取物可以通过影响炎症因子的分泌和酶活性调整牙周组织免疫激活的后续环节[4],还可以抑制牙槽骨吸收[5]，促进骨髓基质干细胞的成骨分化[6]，从而达到抗菌消炎、促进骨质再生的药理作用[7]。黄芩提取物可促进碱性磷酸酶产生，刺激细胞成骨转化[8]；还可引起RANKL诱导的破骨细胞数量减少，炎性因子下降，从而使牙槽骨丧失减缓或停止，达到减轻牙周炎症的效果[9]。

前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸的代谢物，它是炎症诱导骨吸收的关键调节剂。在牙周炎的病理发展过程中，PGE2可作为一种重要的炎症介质参与其中：在炎性牙龈组织和龈沟液中，PGE2会显著增加。同时，PGE2也是一种重要的刺激骨吸收的因子，研究表明牙周组织的破坏与高水平的PGE2密切相关[10]。Georgios等比较研究了龈上菌斑和龈下菌斑对人牙龈成纤维细胞产生PGE2的影响，其可以成为牙周局部组织破坏的诱导剂[11]，且PGE2的破骨效应与RANKL-OPG系统有关。

C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)作为细菌感染和严重组织损伤的诊断指标之一，在一些急慢性炎症性疾病(如风湿性关节炎等)、心肌梗死、组织损伤、感染及肿瘤等疾病中，其水平可有明显升高；CRP还可作为手术感染及并发症的指标，当术后CRP水平不降低或者再次升高时就提示有并发感染或血栓栓塞的可能；在大多数细菌性感染中，血清CRP的水平会升高，而多数病毒性感染则不升高，因此CRP还可作为两者的鉴别诊断指标；CRP不仅是心血管疾病的警报器，在牙周炎患者中也观察到有明显的升高[12]。Maekawa等[13]通过实验证实牙周局部感染引起CRP升高可能是牙周局部炎症的致病机制之一，并且在一定的程度上，牙周局部的CRP还能潜在调节肝外CRP产生的系统性CRP水平。

本实验在成功建立SD大鼠实验性牙周炎动物模型的基础上，采用局部注射单独或者配伍的大黄、黄芩有效部位药物，观察对大鼠龈沟液、唾液及血液中PGE2和血液中CRP炎性因子含量的抑制作用及促进骨组织再生的影响，为进一步将大黄、黄芩联用药物用于临床治疗牙周炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物与试剂

大黄有效部位(质控指标成分大黄素含量30%)、黄芩有效部位(质控指标成分黄芩素含量80%)均购自陕西飞达生物有限公司，使用时用灭菌水配判成13 mg/L浓度的大黄有效部位和5 mg/L浓度的黄芩有效部位进行局部注射治疗；戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)；PGE2、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)的ELISA试剂盒(美国R&D公司)；超纯水仪(Milipore,法国)。

1.2 实验动物

100只3个月龄SD大鼠，清洁级，雄性，牙列完整，无龋坏及牙周病，体质量(170±10)g(由西安交通大学医学部动物实验中心提供)。所有大鼠均可自由饮水，分笼饲养，动物实验经过西安交通大学口腔医院伦理委员会审核并批准。

1.3 SD大鼠实验性牙周炎动物模型的建立与分组

所有大鼠先适应性饲养1周，用复方新诺明混悬液(2%)代替日常饮水预处理1周，再换回正常饮水1周。按照体质量对等原则随机分为5组：假手术组(Sham组)、牙周炎组(P组)、大黄有效部位组(DH)、黄芩有效部位组(HQ)和大黄、黄芩配伍药组(DH+HQ)，每组20只。

假手术组仅在麻醉后在双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈沟底注射20 μL无菌PBS，并涂100 μL的PBS溶液建模；其余各组在双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈沟底注射牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanusgingivalis,P.g, W83，购于首都医科大学)菌液20 μL(2×1010CFU/mL)，并使用结扎丝线结扎牙颈部，然后于结扎丝线处涂抹100 μL菌液(1.5×109CFU/mL)。每隔2天重复1次，共4次。建模后8周，各组SD大鼠拆除结扎丝开始进行局部药物治疗。参照课题组前期实验获得的药物有效浓度，采用13 mg/L浓度的大黄有效部位和5 mg/L浓度的黄芩有效部位单独以及配伍进行局部注射处理；假手术组和牙周炎组给予局部注射等量生理盐水，连续药物治疗4周。建模期间，所有大鼠均饲以软食。

1.4 SD大鼠牙周组织病理形态学观察

SD大鼠下颌骨病理形态学观察，建模8周后取SD大鼠左侧下颌骨磨牙段立即放入4%的多聚甲醛内固定48 h后取出，100 g/L EDTA脱钙3周，常规石蜡包埋，沿下颌正中冠状断面切成5 μm厚的连续切片，HE染色后于光镜下观察、照相。

1.5 ELISA法检测唾液、龈沟液和血液中的PGE2含量及血液中的CRP含量

各组大鼠连续局部药物治疗4周后，腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，3 500 r/min离心15 min，取血清；用滤纸条取大鼠口腔内唾液和双侧上颌第二磨牙颊舌侧龈沟液，所有标本于-70 ℃保存。测定前将样本和试剂盒取出，室温下解冻30 min，用ELISA试剂盒检测大鼠龈沟液、唾液及血清PGE2水平和血液CRP水平。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行[14]。

1.6 SD大鼠骨组织形态计量学参数的测量

各组大鼠下颌骨磨牙段常规制片[15]，采用Micro CT对骨组织进行拍照，再利用Motic微机图像处理系统进行骨组织形态学各参数的测量：在光镜下采集下颌最后一个磨牙根部远中松质骨图像，依照等距随机抽样原则，同一标本选3张切片，每张切片选3个观察视野。用MoticMed6.0数码医学图像分析系统对上面所得图像进行骨组织形态计量学相关参数测定[16]。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组SD大鼠组织病理形态学观察

建立大鼠牙周炎模型之后，采用不同的药物进行治疗4周，大鼠上颌第二磨牙组织病理学观察可见：DH组大鼠牙槽骨可见有少量破骨细胞和骨吸收陷窝(图1A)，HQ组可见有少量成骨细胞形成(图1B)，DH+HQ配伍组成骨细胞比单独的HQ组明显增多(图1C)，P组牙龈结合上皮与牙槽骨分离，牙槽嵴顶位于根中1/2，并且参差不齐，根分叉处有明显的骨吸收区，破骨细胞及单核细胞增多(图1D)；Sham组牙龈结合上皮底位于釉牙骨质界处，牙槽嵴顶和根分叉处牙槽骨形态和高度正常，未见破骨细胞及单核细胞(图1E)。

A:DH组：牙槽骨可见有少量骨吸收陷窝和破骨细胞( ×40)；B:HQ组：可见有少量成骨细胞形成( ×40)；C:DH+HQ组：相对单独HQ治疗组有大量成骨细胞产生( ×40)；D:P组：牙龈结合上皮与牙槽骨分离，牙槽嵴顶位于根中1/2，并且参差不齐，根分叉处有明显的骨吸收区，破骨细胞及单核细胞增多( ×4)；E:Sham组：牙龈位置，牙槽骨高度正常，未见牙槽骨吸收和炎性细胞( ×4)(均为蓝色箭头示)

2.2 各组SD大鼠龈沟液、唾液和血液中PGE2含量比较

SD大鼠经过不同分组的药物进行局部治疗4周后，利用ELISA试剂盒测定各组SD大鼠的PGE2含量，经过K-S检验提示符合正态分布，方差分析结果提示总体有差异(P<0.05)，两两比较结果显示，牙周炎组(P组)大鼠龈沟液、唾液及血液中的PGE2水平显著高于假手术组(Sham组)(P<0.05)，说明建立牙周炎模型后SD大鼠体内炎症因子PGE2水平显著上升；而经过大黄、黄芩有效部位单独和配伍组局部用药可明显降低SD大鼠龈沟液、唾液以及血液中的PGE2水平：DH和HQ单独用药组的龈沟液、血液中PGE2含量仍然高于Sham组(P<0.05)，唾液中PGE2含量和Sham组无统计学差异；而DH+HQ配伍组的龈沟液、唾液和血液中PGE2含量和Sham组均无统计学差异；和P组比较：DH和HQ单独组只有唾液中的PGE2含量显著下降，龈沟液和血液中的PGE2含量无明显差异；DH+HQ配伍组的龈沟液、唾液和血液中PGE2含量均明显低于牙周炎组，并有统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 SD大鼠龈沟液、唾液和血液中的PGE2含量比较

2.3 各组SD大鼠血液中CRP含量比较

SD大鼠经过不同分组的药物进行局部治疗4周后，利用ELISA试剂盒测定各组SD大鼠血液中的CRP含量，结果经过K-S检验提示符合正态分布，经方差分析提示总体有差异(P<0.05)，LSD-t法组间两两比较结果显示：相对于Sham组，P组大鼠血液中的CRP含量明显升高，且有统计学意义(P<0.05)；药物治疗后虽然DH、HQ单独和DH+HQ联用组的CRP含量相较于P组均有所下降，但是只有DH+HQ联用组的下降和P组比较具有统计学差异(P<0.05)；DH+HQ联用组和Sham组无明显差异，DH、HQ单独药物组和Sham组有明显差异(表2)。

表2 SD大鼠血液中的CRP含量比较

2.4 SD大鼠形态计量学参数的比较

各组SD大鼠建模后再经过药物治疗4周后，上颌第二磨牙的Micro CT图像如图2所示:DH药物治疗4周可见根分叉有少量骨质再生(图2A)；经HQ药物治疗组可见根分叉骨再生优于DH治疗组(图2B)；DH+HQ药物联用组的根分叉有大量骨再生，优于单独用DH和HQ组(图2C)；P组的根分叉只有极少量骨再生(图2D)；Sham组的根分叉区骨质未见明显吸收(图2E)。骨组织形态学各参数经过K-S检验提示符合正态分布，经方差分析提示总体有差异(P<0.05)，LSD-t法组间两两比较结果显示：相对于Sham组，P组大鼠的骨小梁各参数均有明显下降，且有统计学意义(P<0.05)；药物治疗后仅DH+HQ联用组的骨组织形态学各参数相比较P组有明显差异(P<0.05)：相对骨体积(BV/TV)、骨表面积体积比(BSA/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)比P组明显升高，骨小梁间隙(Tb.Sp)和骨小梁模型因子(Tb.Pf)明显降低；和假手术组均无明显差异(表3)。

A:DH组：根分叉可见少量骨再生；B:HQ组：根分叉部分骨再生多于DH组；C:DH+HQ联用组：根分叉大量骨再生，优于单独使用DH和HQ组；D:P组：根分叉有极少量骨再生；E:Sham组：根分叉区骨质未见明显吸收

表3 各组药物局部治疗4周后SD大鼠骨小梁参数比较

3 讨 论

牙周病的细菌学研究证明，牙周病是由细菌感染所致，特别是革兰阴性厌氧杆菌，如牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和具核梭杆菌[17-18]。中药药理学研究发现，大黄的有效成分为蒽醌类衍生物(如大黄素、大黄酸、大黄酚等大部分与葡萄糖结合为苷的结合状态)[19]，可以针对常见牙周致病菌发挥明显抑菌作用，其作用机制可能是干扰厌氧菌细胞壁的形成；还可通过降低毛细血管通透性，调节机体免疫力，消除自由基和保护细胞功能，同时能够显著抑制内毒素激发的巨噬细胞内钙离子升高，抑制前列腺素、白细胞介素的产生，从而抑制巨噬细胞脂类炎性介质活化过程，达到抑制炎症介质发挥抗炎作用[20]。黄芩中可提取出黄芩素、黄芩苷等黄酮类的有效成分，具有促进牙周膜细胞增殖、增加细胞总蛋白和胶原含量，抗细胞粘附作用来保护细胞功能[21]，清除氧自由基、免疫调节和抗肿瘤等多方面的功能[22]；还可以通过降低牙周炎大鼠牙龈组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP-9)和白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)的mRNA的表达含量[23]，联用其他药物抑制脂多糖、炎症因子PGE2的合成，来改善大鼠牙周组织状况[24]；同时黄芩水煎剂和水浸膏还可以有效抑制牙周可疑致病菌的生长，抑制牙槽骨吸收[25]。本实验基于课题组前期实验结果，采用不同浓度的大黄、黄芩有效部位对人牙周膜细胞增殖活性和产生炎性因子PGE2的影响，选择13 mg/L浓度的大黄有效部位和5 mg/L浓度的黄芩有效部位单独或者配伍治疗SD大鼠实验性牙周炎动物模型，观察其组织病理学、炎性因子PGE2和CRP含量和牙槽骨再生的情况。

牙周炎的症状主要包括牙龈炎症，牙周袋的形成，牙槽骨丧失及牙齿的松动甚至脱落。在本次研究中，假手术组(Sham组)牙槽骨未见骨质吸收和破骨细胞(图1 E)；而通过结扎丝和细菌涂抹的方式建立实验性牙周炎动物模型后，对建模后的牙周炎大鼠(P组)进行了组织病理学观察，可见其牙龈沟底结合上皮与牙面分离，根分叉区可见到牙槽骨表面成排的破骨细胞形成，骨表面参差不齐(图1 D)，证实本次实验建立的模型符合牙周炎的要求；经过DH、HQ或者DH+HQ配伍药物组治疗后，可见不同组的大鼠牙槽骨出现不同数量的破骨细胞和成骨细胞，DH+HQ联用组的成骨细胞形成最多，有更好的成骨效应(图1 A,B,C)。

本实验通过对SD大鼠龈沟液、唾液和血液中的PGE2含量进行统计分析，可见P组大鼠龈沟液、唾液及血液中的PGE2水平显著高于Sham组(P<0.05)，说明建立牙周炎模型后SD大鼠体内炎症因子PGE2水平显著增加；而经过大黄、黄芩有效部位单独和配伍组局部用药后可明显降低PGE2水平，且DH+HQ配伍组的龈沟液、唾液和血液中PGE2含量和Sham组均无统计学差异，而和P组比较龈沟液、唾液和血液中PGE2含量均明显低于牙周炎组，并有统计学差异(P<0. 05)(见表1)，这说明大黄、黄芩药物对实验性牙周炎动物牙周组织产生PGE2有抑制作用，且配伍联用组对牙周炎PGE2产生的抑制作用最明显。通过分析血液中CRP的含量结果说明：牙周炎建模成功后P组大鼠的CRP含量明显高于Sham组，说明其炎症显著，而经过不同组的药物治疗后虽然都比P组降低，但只有DH+HQ联用组的下降与P组有统计学差异，说明联用组消炎效果是优于单独药物组的。

Micro CT的主要应用领域之一是对骨骼的研究，尤其是骨小梁，近年来已经越来越多地应用于牙周骨组织再生的评估[26]。对骨的描述一般采用三维参数计量，其中相对骨体积(BV/TV)，骨表面积体积比(BSA/BV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数目(Tb.N)这几个参数的数值越大说明骨的健康状况越好，骨小梁模型因子(Trabecular bone pattern factor, Tb.Pf)是1992年由Hahn等首次提出的，是一种以衡量骨小梁凸面和凹面程度来定量测量连通性的指标：先测量出结构的表面积(BS)和体积(BV)，然后利用膨胀将整体结构的体素增加一个单位的厚度，再次计算出骨小梁结构膨胀后的表面积(BS’)和体积(BV’)就可计算出Tb.Pf；它和骨小梁间隙(Tb.Sp)一起作为新的表示骨小梁连续性的参数，表示骨小梁柱状梁和板状梁的相互转化：其值越小，表示骨小梁的连续性越好，提示骨小梁由杆状向板状发生变化[27]。通过表3的骨组织形态学参数的分析表明，大黄、黄芩配伍组的各参数均与牙周炎组有显著的差异，且优于单独的药物组，进一步体现了药物联用后有更好的成骨作用。

综上所述，采用结扎丝和细菌涂抹的方式可以成功建立SD大鼠实验性牙周炎动物模型，而13 mg/L浓度的大黄有效部位和5 mg/L浓度的黄芩有效部位配伍后进行局部注射治疗SD大鼠的实验性牙周炎，可以明显降低牙槽骨破骨细胞、增加成骨细胞数量，降低龈沟液、唾液以及血液中的PGE2含量和血液中的CRP含量，增加局部牙槽骨再生、调整骨组织形态学各参数水平，因此具有一定的改善牙周组织局部炎症和促进局部骨组织再生的效果，但其具体的作用机制尚需后续实验进一步深入探讨。