一起金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒事件溯源调查

游兴勇，周厚德，蔡军，刘洋，刘成伟

（1.江西省疾病预防控制中心 江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌330029；2.南昌市东湖区疾病预防控制中心，江西 南昌330000）

金黄色葡萄球菌是食物中毒事件的常见病原菌，其产生的肠毒素污染食品，能引起恶心、呕吐、腹痛等急性胃肠炎症状[1]。 金黄色葡萄球菌引起的食物中毒已经成为全球关注的突发公共卫生事件。 2017 年9 月21 日，某市发生一起较为严重的儿童食物中毒事件，通过实验室分子溯源检测，最后确定为是一起以分泌SEA 型和SED 型肠毒素的两种金黄色葡萄球菌污染草莓卷引起的食物中毒事件。 报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 本次调查一共采集样品43 份，其中病人生物标本12 份，食品样品标本为25 份，企业环境样本6 份。

1.1.2 试剂耗材 选择性培养基（青岛海博），沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、致泻大肠埃希氏菌和弧菌的显色培养基（科玛嘉），肠毒素分型检测试剂盒（北京良润生物），肠毒素荧光定量PCR 试剂盒（深圳生科源），限制性内切酶XbaI 和SmaI（日本TakaRa），蛋白酶K（美国Merck），葡萄球菌溶菌素（美国Sigma），Gel-red（美国Biotium）。

1.1.3 主要仪器 荧光定量PCR 仪、脉冲场凝胶电泳系统（美国Bio-Rad）、比浊仪（法国Vitek）、全自动酶联免疫仪（美国Molecular Devices）。

1.2 方法

1.2.1 标本检测 参照2017 版《国家食品安全风险监测手册》,对采集的食品样品开展沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌等致病菌的检测。 环境样本、 粪便标本检验参照2017 版《国家食源性疾病监测手册》的标准方法。

1.2.2 肠毒素检测 按照金黄色葡萄球菌肠毒素ELISA 检测试剂盒说明书，对分离菌株进行产毒培养基培养后，采用ELISA 方法进行SEA-SEF 肠毒素检测试验。 PCR 检测上，采用DNA 提取试剂盒，沸水浴方法提取金黄色葡萄球菌DNA, 参照试剂盒说明书构建SEA-SEE 荧光定量PCR 体系，对分离株进行肠毒素基因进行分型。

1.2.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型 参照国家食品安全风险评估中心TratNet 标准实验方法，用葡萄球菌溶菌素、裂解液使细胞在胶块中原位裂解，将胶块洗涤后的用SmaⅠ限制性内切酶进行酶切，酶切后的胶条按照标准操作要求灌胶后进行脉冲场凝胶电泳。

电泳条件： 45kb 低分子量，450kb 高分子量，电泳温度14℃，时间19h，其它为默认设置。电泳结束后,将凝胶取出，用0.1 μg/ml 的Gel-red 染色并脱色。电泳的DNA 图谱用BN7.6 软件分析，以SmaⅠ酶切的H9812 进行校准。 通过采用Dice 系数并用非加权组平均法(UPGMA)(Bionumerics 7.6 美国)分析后输出树状图谱[2]。

2 结果

2.1 流行情况 2017 年9 月5 日下午六点半开始，某市乡镇卫生所陆续收到7 名剧烈呕吐的就诊病例，直接转入省儿童医院，同一时间有另外两家幼儿园的小朋友在省儿童医院救治, 三家幼儿园共120 名左右的患者，全部病例症状相似，以呕吐、腹泻为主的急性胃肠炎表现。 截止9 月13 日，所有病例全部出院，无继发病例和危重病例出现。 三家幼儿园共同的食物“草莓卷”均为同一食品公司生产。

2.2 检验结果

2.2.1 金黄色葡萄球菌分离与鉴定 本起事件采集的食品、粪便、厨师加工用刀具、砧板、厨房台面等环境样本进行增菌、划线接种后，除Baird-Parker平板显示有金黄色葡萄球菌可疑菌落外,其余培养基上均无可疑菌落生长。 将金黄色葡萄球菌分离在科玛嘉显色平板上,检出16 株金黄色葡萄球菌，其中病人生物标本4 份，食品样品标本为7 份，企业环境样本5 份。 将16 株分离菌进行兔血浆凝固酶、血平板溶血、乳胶凝集生化试验，结果均为阳性。

2.2.2 肠毒素检测和分型 ELISA 检测试剂盒说明书结果显示，16 株分离株均呈现肠毒素阳性，其中14 株为SEA，2 株为SED 肠毒素，具体为4 份病人样本中共检出肠毒素3 份SEA 和1 份SED，7 份食品样本基本均来自草莓卷食品，7 份食品样本和5 份企业环境样本的12 株分离株共检出肠毒素11 份SEA 和1 份SED，荧光定量PCR 试剂盒方法基因检测结果也显示与ELISA 表型一样的结果。

2.2.3 PFGE 结果 16 株产毒株经SmaI 酶切后进行PFGE，16 株菌除10 株成功分型外，有6 株因降解和DNA 浓度低等原因未能成功分型。 聚类分析以相似度为80%视为同一类菌株,结果显示分泌肠毒素SED 的病人菌株和食品菌株为一类, 其余分泌肠毒素SEA 的菌株为一类, 提示污染可能来自两种不同的金黄色葡萄球菌克隆株。

图1 金黄色葡萄球菌肠毒素荧光定量PCR 结果

图2 PFGE 经SmaI 酶切后的分子分型图谱

3 讨论

金黄色葡萄球菌是近年来社区和医院感染的重要危险致病菌之一，其致病性强，感染速率高，传播度快，耐药性强，为疾病治疗带来了极大困难[3]。 谢筱莉等[4]对本地院内分离的金黄色葡萄球菌的相关研究表明,金黄色葡萄球菌耐药性仍是临床重要问题尤其是MRSA 的检出率高于国内其他地区。

目前已报道的金黄色葡萄球菌肠毒素种类有10 种[5]，其中A 型毒力最强，其引起的食物中毒也最多[6]。 市售食品中金黄色葡萄球菌均有检出，国译丹等[7]报道的云南省食品中金黄色葡萄球菌总检出率为2.85%，其中肉与肉制品、餐饮食品污染严重。 随着网络外卖食品的兴起，近年来金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生，2016 年河北省石家庄市某高校多名学生因食用网购食品引起金黄色葡萄球菌食物中毒[8]。2017 年浙江省宁海县某学校因外卖集中配送餐污染金黄色葡萄球菌引起29 人食物中毒[9]。

本次事件中共有140 名幼儿中毒,涉及3 家幼儿园，通过流行病学调查和临床症状等分析，初步判定为金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。 从病人、食品及生产企业环境中共采集了43 份样本， 共分离了16 株金黄色葡萄球菌，均经过生化等方法鉴定确认。 未分离到其它致病菌。 金黄色葡萄球菌肠毒素检测是确定金黄色葡萄球菌食物中毒的重要依据， 目前主要采用ELISA、 荧光定量PCR、 动物实验等方法，其中实时荧光PCR 方法以其灵敏度较高、检测快速的优势，已经成为首选的方法[1]。 本实验共分出14 株分泌A 型肠毒素和2 株分泌D 型肠毒素的金黄色葡萄球菌。 10 株PFGE 成功分型的金黄色葡萄球菌显示为来源于2 种不同的金黄色葡萄球菌克隆株。 综合流行病学调查和实验室结果，可以判定本次事件是由SEA、SED 型的两种金黄色葡萄球菌污染草莓卷引起的一起食物中毒事件。

金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布,从食品原材料、生产加工、流通经营到最后食用都有污染的可能。 本次事件调查结果证实为一起因金黄色葡萄球菌污染原材料后未进行有效的消毒,造成生产加工过程中的二次污染而导致了食物中毒。 因此，生产者应加强食品生产各个环节的监督检查，重点落实好原材料、加工过程的消毒和灭菌，最大限度地保障该类食品的食用安全， 降低食物中毒的风险。