人脐带间充质干细胞的分离技术优化及其快速检测体系的建立

张岳汉，钟志辉，黄林燕，刘宣瑜，邱振华

（高州市人民医院干细胞与再生医学中心，广东 高州525200）

间充质干细胞主要是指一种源自中胚层，且具有自我更新以及多向分化潜能的成体肝细胞，广泛存在于全身的器官间质以及结缔组织中，主要囊括骨髓间充质干细胞、 脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）以及脂肪间充质干细胞[1,2]。 其中UCMSC 具有来源丰富、获取成本较低、不涉及论文问题以及对捐献者无损害等优点,可能是未来间充质干细胞应用于医疗中最具有潜力的理想选择[3]。 目前，临床上应用于人UCMSC 分离培养的方式较多,且各有千秋，所获得的细胞质量存在明显的差异[4]。由此可知,如何获取相对可靠、安全以及优质的UCMSC 已成为细胞分离生产技术的重大问题。 有研究报道显示[5,6],间充质干细胞作为一类特殊的生物制剂药物,于生产过程中必须保证生物学活性、分化能力以及增殖能力,同时需有效控制在此过程中外来微生物可能引起的感染。 鉴于此，本文通过研究人UCMSC 的分离技术优化及其快速检测体系的建立效果并予以分析。 旨在为寻找一套可快速、可靠、安全的检测体系,继而于最短时间内对间充质干细胞实施监测，并回输至宿主体内，为人UCMSC 的分离以及检测寻找一种更加优化的手段，报告如下。

1 资料与方法

1.1 脐带来源 选取2018 年3 月-2018 年6 月于我院进行分娩的20 例健康新生儿脐带组织标本作为研究对象，将其以随机抽签法等分成2 份，即研究组与对照组。 纳入标准：⑴所有新生儿脐带组织均于产妇及其家属同意下，由我院妇产科采集，即待胎盘彻底脱离母体后,采用无菌生理盐水完成脐带的清洗，随后对脐带两端予以结扎，每例脐带采集长度≥20cm；⑵新生儿均为足月分娩；⑶均为初产妇。 已获得纳入对象家属同意，并得到医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法 ⑴传统贴壁法：将所获取的脐带进行血管清除处理,随后将其剪为0.5～0.8cm 的大块，并接种在100mm 培养皿内, 保证脐带切面向下贴壁,接种密度以25 块为宜。 放置于培养箱中,于37℃，5%浓度的二氧化碳状态下静置5h，加入2ml 的培养液（主要为DMEM 培养液+10%FBS 培养液），并于24h 后再次加入10ml 的培养液。2d 后进行半量换液处理,之后定期5d 进行1 次全量换液，培养12d 后换液去除大部分的漂浮组织，待细胞≥80%左右贴壁或（继而）较多局部细胞群落密集时，即可开始传代。 ⑵优化分离技术：将获取的脐带去除血污并进行消毒，使用眼科剪将脐带对半剪开，除去动静脉,使用无菌刀柄将胶状物从脐带内壁上刮下来，将胶状物剪碎1mm×1mm 大小，接种密度以300～350 小块为宜。 将其置于培养箱中静置30min后加入2ml 的原代培养液，放置于37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中进行培养处理， 并于24h 后再次加入10ml 的培养液。 之后定期6d 进行1 次全量换液,培养9d 左右若见组织泥漂浮于培养液中，去除大量的漂浮组织并予以换液，待细胞≥80%左右贴壁或（继而）较多局部细胞群落密集时，即可开始传代。 ⑶细胞体外培养传代：每天于显微镜下对不同分离方式获取的细胞生长情况予以观察，并记录获取原代细胞生长所用时间,即初次见贴壁细胞以及80%贴壁/可传代时间。⑷细胞计数：采集细胞悬液,500g 离心5min 处理，随后采用细胞计数板完成细胞计数。 即待细胞悬液静置30min 后，在显微镜下观察,并计算细胞计数板4 个大方格内所具有的细胞数。 细胞得率计算公式为80%踢被细胞悬液总数与分离长度的比值。 ⑸细胞增殖情况检测：分别取不同方式获得的细胞，获取第3 代、6代、9 代细胞。 以单细胞悬液为目标对其进行制备,并接种于24 孔板, 加入DMEM+10%FBS 培养液，放置在37℃，5%浓度二氧化碳的培养箱中进行培养。 定期3d 换液1 次，分别取3 孔不同代细胞的计数，取平均值。 ⑹检测方式：对照组采用传统细胞检测方式； 研究组则采用质谱仪完成细菌感染性方面的检测, 以荧光PCR 技术完成和支原体感染方面的检测。 其中成骨分化茜素红染色、成脂肪分化油红“O”染色以及成软骨分化切片染色，见图1、图2、图3。

图1 成骨分化茜素红染色

图2 成脂肪分化油红“O”染色图

图3 成软骨分化切片染色

1.3 观察指标 比较两组细胞生长情况以及得率情况，第3 代、6 代、9 代细胞的增殖情况，细胞检测时间。

1.4 统计学方法 数据分析主要通过SPSS21.0 软件进行处理，且以[n(%)]对计数数据实施表示，予以2 检验。以（±s）对计量数据实施表示，予以t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞生长情况以及得率情况对比 研究组初次见贴壁细胞时间、80%贴壁/可传代时间相比对照组较低，而细胞得率相比对照组较高（均P＜0.05），见表1。

表1 两组细胞生长情况以及得率情况对比（x±s）

2.2 两组第3 代、6 代、9 代细胞的增殖情况对比研究组第3 代、6 代、9 代细胞4d、8d 时的细胞数均高于对照组（均P＜0.05），见表2、图4。

图4 处于增殖期的脐带间充质干细胞

2.3 两组细胞检测时间对比 研究组细胞检测时间为（0.81±0.15），相比对照组的（2.34±0.21）d 较低，差异明显（t=18.748，P=0.000）。

3 讨论

间充质干细胞的治疗技术目前已得到国内外广泛研究学者的关注,为部分疑难杂症的治疗带来了希望[7-9]。 然而，干细胞治疗的安全性、有效性不但和干细胞制剂的本身有关,同时与干细胞制备环节密切相关,间充质干细胞的制备是否符合质量标准，且不受污染影响，直接决定了其在临床中的可行性、安全性[10-12]。 既往，临床上应用较为广泛的分离人UCMSC 的手段囊括组织块法、 酶解组织法、联合酶消化法等[13-16]。 不同的分离手段存在不同的优点和不足之处：其中组织块法具有操作简单、不会损伤细胞以及细胞活性较佳等优势,然而该技术的培养周期相对较长，且获得率不理想，无法迅速获取人UCMSC。酶解组织法存在消化时间较长，传代后细胞的贴壁率较低等缺陷[17,18]。 而联合酶消化法消化时间较长，操作复杂，且由于消化时间的掌握难度较高，从而极易导致细胞粘附性下降，进一步引起贴壁率较低，最终导致试验失败[19,20]。 目前，临床上针对间充质干细胞的细菌培养检测所需时间较长，无法为细胞回输的当天获取结果，因此无法为细胞的回输提供安全保障。 而随着近年来医疗水平的不断发展, 质谱技术以及荧光PCR 技术开始被应用于临床中,可能成为间充质干细胞和质量检测的有效手段，具有较高的临床研究价值。

表2 两组第3 代、6 代、9 代细胞的增殖情况对比（例，x±s）

本研究结果表明, 研究组初次见贴壁细胞时间、80%贴壁/可传代时间相比对照组较低，而细胞得率相比对照组较高，与此同时，研究组第3 代、6代、9 代细胞4d、8d 时的细胞数均高于对照组，这表明了优化法应用于人UCMSC 的获取中具有高效、稳定的优势，且操作简单、可控性强，值得临床推广应用。 究其原因，本研究所采用的优化法主要是利用了人UCMSC 的趋化性特点，促使其自发聚集于创口部位，继而爬出组织且开始贴壁生长。 同时， 该法有利于细胞维持原有的活性以及生长趋势，且在分离过程中会对细胞造成损伤，因此在换液传代后可获得更为明显的细胞增殖能力。 此外，该法所获取的脐带组织更为细小,从而使得其贴壁牢固性更佳，继而可缩短爬出细胞的时间，进一步缩短可传代用时。 笔者体会：优化法主要是利用物理方式自脐带胶状组织内提取UCMSC, 且相比传统贴壁法带脐带内皮组织一起剪碎等一步骤，在一定程度上缩短了操作时间。 其在刮下来的胶状组织，更有利于贴壁，并在加液后不会轻易漂浮，细胞更易爬出，获得到的细胞更纯。 加之换液的次数相对较少，可有效节省人力物力。 另外，研究组细胞检测时间相比对照组较低,这提示了快速检测体系的建立有利于缩短人UCMSC 的检测时间，避免了医疗资源的浪费，减轻了医务人员的工作量。究其原因,笔者认为质谱仪主要是利用高能电子流等对样品分子予以“轰击”，从而促使该分子丧失电子转变成待正电荷的分子离子以及碎片离子，而上述差异性离子的质量不同,与磁场的作用下到达检测器的时间亦存在差异，继而形成质谱图，为临床检测提供可快速、可靠的数据。荧光PCR 主要是指于PCR 反应体系内加入荧光基团, 从而利用荧光信号对整个PCR 过程予以监测, 随后利用标准曲线完成未知模板定量分析的一种手段,目前已被广泛应用于临床中，效果明显[21]。

综上所述，优化法可高效、低成本地获取高质量人UCMSC, 且与操作方面完全可建立一套规范的标注你操作规程以及质量控制流程。 同时，快速检测体系的建立可显著缩短人UCMSC 的检测时间，有利于避免医疗资源的过度浪费，值得临床推广应用。