宫颈鳞状上皮FoxM1及Cdc25B细胞核内蛋白水平与高危型HPV感染的相关性研究

梁 琳，万晓春，危 平，常 彬，向礼兵，朱琳琳，平 波

1.复旦大学附属肿瘤医院病理科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.复旦大学附属肿瘤医院妇瘤科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，其中宫颈鳞癌（squamous cell carcinoma，SCC）最多见，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）为宫颈鳞癌的癌前病变。宫颈细胞学与高危型人乳头状瘤病毒（high-risk human papilloma virus，hrHPV）检测是目前宫颈癌筛查的主要方法，虽然细胞学和hrHPV检测分别有灵敏度和特异度相对较低的局限性。此外，上述联合检查在大规模人群筛查中成本高昂，反观超80%的宫颈癌发生于发展中国家，20年来中国宫颈癌发病率和死亡率呈逐年升高趋势［1］，中国宫颈癌筛查人群覆盖率仅21.4%［2］。因此仍需寻找高性价比的新方法和筛查策略。

HPV与宫颈癌/癌前病变发生关系密切，其基因组中E6和E7为癌基因，二者的转录受HPVE2基因编码蛋白抑制。转录因子FoxM1参与细胞增殖和细胞周期调控，并在恶性肿瘤发生、发展中发挥重要作用。Thierry等［3］和Pang等［4］分别在HPV16和HPV18阳性的细胞系中过表达HPV E2后发现FoxM1基因表达下降［3-4］。有报道在不同器官来源的细胞系中发现HPV E6有调节FoxM1基因和蛋白水平的功能，虽然此二项研究否定HPV E7对FoxM1表达有调控作用［5-6］，有证据表明，细胞系中改变HPV E7表达水平可调节FoxM1蛋白的表达［4，7-8］。免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）检测已发现FoxM1蛋白可表达于人宫颈癌及其癌前病变组织，但很多IHC研究或未同时检测HPV表达［9-15］，或仅检测了少量病例的HPV16和18［16］，或对FoxM1蛋白的细胞质和胞核表达混合评价，甚至不予区分［11，14，16-17］。因此，为发掘新的HPV感染状态替代性标志物，本研究验证FoxM1蛋白在细胞核内的表达与HPV在体内宫颈鳞状上皮中表达的相关性，并检测FoxM1基因下游主要以核蛋白形式参与细胞周期调控的Cdc25B的表达。

1 资料和方法

1.1 病例收集

经复旦大学附属肿瘤医院医学伦理委员会审核，收集来自复旦大学附属肿瘤医院病理科资料库2007—2009年间宫颈活检、锥切或全子宫切除石蜡包埋标本。入组标准：①所有病例均无其他恶性肿瘤病史；② 正常（含炎症）组织必须来源于既往无宫颈癌及CIN病史，且无细胞学异常病史的患者；③正常或CIN患者经过6个月随访，未出现更高级别病变者；④ 经连续切片首尾张H-E染色保留鳞状上皮（正常标本）和病灶（CIN及以上标本）；⑤ 提取DNA的内参为阳性；⑥ 获得患者或家属签署的知情同意书。

1.2 HPV DNA检测

使用中国国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）认证的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-反向点杂交法HPV基因分型检测试剂盒［亚能生物技术（深圳）有限公司］，按厂商说明对石蜡切片进行检测和结果判读（图1），可检测23种HPV亚型，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4、6、11、42、43和44。

图1 PCR-反向点杂交法HPV基因分型检测Fig.1 HPV genotyping by PCR-reverse dot blot

1.3 IHC检测

石蜡包埋组织按3 µm厚度连续切片，常规脱蜡至水。采用EnVision+两步法和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，一抗来源、抗原修复条件及稀释浓度见表1，抗原修复液均为0.01 mol/L pH=6.0的枸橼酸缓冲液，二抗及DAB均购自丹麦DAKO公司。

IHC结果阳性标准如下：

①FoxM1、Cdc25B和Ki-67：棕黄色颗粒着色于细胞核，鳞状上皮自基底层向上，着色超出全层下1/3为阳性；② P16INK4a（P16）：棕黄色颗粒着色于细胞核或细胞核加细胞质，鳞状上皮自基底层向上，着色超出全层下1/3，并为连续且强的着色（弥漫块状着色）为阳性，局灶、斑片状或单个细胞着色不计为阳性，仅有细胞质着色不计为阳性［18］。

1.4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件对数据进行分析。通过Jonckheere-Terpstra检验分析指标与病变程度之间关系；利用Spearman相关性分析评价指标间相关性；构建受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under curve，AUC）及灵敏度和特异度，评价各指标诊断效果。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 一抗来源、抗原修复条件及稀释浓度Tab.1 Primary antibodies,antigen retrieval and dilution

2 结果

2.1 临床病理学资料

符合入组条件病例共140例，包括正常组22例、CIN1组28例、CIN2/3组50例（CIN2和CIN3分别为3例和47例）、SCC组40例，CIN2+（CIN2/3和SCC）病例共90例。患者年龄分布为22～75岁，中位和平均年龄分别为43和43.81岁。

2.2 HPV感染及IHC检测结果在不同级别宫颈病变组织中的分布

对140例标本的23种HPV基因型DNA检测显示HPV阳性率总计为82.86%（116/140）。将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68定义为14种hrHPV型别，hrHPV阳性率为82.14%（115/140）。感染HPV16和18（HPV16/18）者共计103例。14种hrHPV及HPV16/18在正常组、CIN1、CIN2/3及SCC中的阳性率随宫颈病变严重程度加剧而上升（Jonckheere-Terpstra检验，P均＜0.000 1，表2）。此外高危型中单一型别感染者75例，其中HPV16、18和其他型别感染分别为61例、3例和11例（包括5例HPV58，3例HPV33，HPV56、HPV52及HPV31各1例）。低危型HPV单一基因型感染仅1例，为HPV11感染。无任何HPV感染者24例。

细胞核中FoxM1和Cdc25B蛋白在不同级别宫颈病变中的典型表达图像见图2。两者与Ki-67及P16的阳性率亦均随宫颈病变程度加剧而上升（Jonckheere-Terpstra检验，P＜0.000 1，表2）。50%的CIN1病例FoxM1和Cdc25B阳性，P16和Ki-67阳性率亦分别高达35.71%和46.43%。CIN2+中FoxM1、Cdc25B、P16和Ki-67阳性率分别为100.00%（90/90）、94.44%（85/90）、85.56%（77/90）和97.78%（88/90），其中13例P16阴性者均为CIN2/3病例，FoxM1阳性率为100.00%（13/13）,CdC25B和Ki-67则均为92.31%（12/13）。联合检测P16与其他生物标志物，P16和（或）其他标志物阳性即为联合标志阳性，可见除SCC外，其他类别阳性率均较单独检测P16有不同程度的提高（表2）。

表2 140例宫颈组织中HPV DNA和IHC检测结果分布Tab.2 Results of HPV DNA and immunohistochemical tests for 140 uterine cervical specimens［n (%)］

图2 FoxM1、Cdc25B、P16和Ki-67在宫颈鳞状上皮中的免疫组化染色Fig.2 Immunohistochemistry of FoxM1,Cdc25B,P16 and Ki-67 in uterine cervical squamous epithelium

2.3 细胞核FoxM1和Cdc25B蛋白水平与hrHPV感染、P16及Ki-67阳性率的相关性检验

采用Spearman相关性检验分析由64例仅有HPV16或仅有HPV18感染以及24例无任何HPV感染的病例构成的病例组（HPV16或18，表3）。在此组88个病例中，HPV感染与细胞核FoxM1及Cdc25B蛋白水平均呈较好的相关性，Spearman相关系数（rho值）分别为0.842和0.757（P＜0.000 1，表4）。随后对11例其他hrHPV单一型别感染及24例无任何HPV感染者构成的病例组（其他型别）进行分析，发现这些HPV类型的感染与细胞核FoxM1及Cdc25B蛋白表达亦有较强的相关性（P＜0.000 1，表3～4）。进一步分析14种hrHPV单一及混合型别感染及无任何HPV感染者构成的病例组（14种hrHPV），相关性依然存在（P＜0.000 1，表3～4）。此外，4种标志物表达在相互之间也有较强相关性，尤其FoxM1与Ki-67和Cdc25B之间相关性最强，rho值分别高达0.909和0.840（P＜0.000 1，表5）。

2.4 IHC与hrHPV DNA检测的诊断效果评价

包含FoxM1和14种hrHPV的单独或联合标志的检测灵敏度和阴性预测值（negative predicative value，NPV）均达100%，单独P16检测最低，灵敏度和NPV分别为为85.56%和75.47%，P16与其他标志物的联合检测灵敏度和NPV均提高（98.89%～100.00%）。P16特异度为80.00%，高于其他单独或联合检测（48.00%～72.00%，表6）。14种hrHPV及联合P16检测的AUC值最低，分别为0.750和0.740，其他标志物AUC值范围高达0.822～0.850（图3，表6）。

表3 hrHPV感染情况Tab.3 hrHPV infection of the patients［n (%)］

表4 hrHPV感染与细胞核FoxM1和Cdc25B蛋白过表达的Spearman相关性检验Tab.4 Spearman’s correlation between hrHPV infection and nuclear expressions of FoxM1 and Cdc25B

表5 FoxM1、Cdc25B、Ki-67和P16蛋白水平的Spearman相关性检验Tab.5 Spearman’s correlation test for expressions of FoxM1,Cdc25B,Ki-67 and P16

图3 宫颈标本中各生物标志物对CIN2+诊断效果的ROC曲线Fig.3 ROC curves for the performance of different biomarkers evaluating CIN2+in the uterine cervical specimens

表6 各生物指标诊断CIN2+病变的效果Tab.6 Diagnostic performance of different biomarkers for CIN2+

3 讨 论

转录因子FoxM1在细胞周期循环中对G1/S和G2/M转换相关的重要基因进行转录调控，功能与细胞增殖高度相关，并涉及有丝分裂、凋亡、染色体分离及DNA损伤修复等多环节，在肿瘤发生、发展中具有重要地位［8］。细胞周期不同阶段中，FoxM1蛋白在细胞质之间穿梭，其进入细胞核实施转录调控需要促有丝分裂信号刺激及Raf/MEK/MAPK通路活化［19-20］。有文献［16］报道，宫颈癌的FoxM1蛋白水平与HPV感染无显著相关性，然而该文对FoxM1蛋白的细胞质和细胞核表达进行了混合评分，且仅提供了HPV16和HPV18的感染状况［16］，可能是导致结果差异的原因。

磷酸酶基因Cdc25B在细胞周期中是重要的G2/M转换相关基因，受FoxM1转录活化［21］，有报道Cdc25B基因水平可因过表达HPV E2而被抑制或因过表达E7而被上调，且HPV16 E7被招募到Cdc25B基因启动子区域［4］。本研究对宫颈组织中Cdc25B核蛋白进行了IHC检测，发现其表达不仅与细胞核FoxM1蛋白表达相关，也与HPV感染具有相关性，与体外研究结果相符。

由于体外HPV对FoxM1和Cdc25B的调控研究主要经表达或敲除HPV16或HPV18 E6/E7的方法，而人宫颈组织中感染HPV的基因型多样，并可为单一或多型别感染，我们着意分析了HPV16和18以外的hrHPV单一型别感染是否有类似相关性。虽然病例数较少，但在11例其他hrHPV单一型别感染（包括5例HPV58，3例HPV33，HPV56、HPV52及HPV31各1例）及24例无任何HPV感染者构成的病例组中，依然可见这些型别感染与细胞核FoxM1及Cdc25B蛋白表达有较强的相关性，Spearman相关系数分别为0.867和0.937，要考虑不同型别的hrHPV均可能有上述调控作用。

FoxM1和Cdc25B的IHC判断标准中，关于“鳞状上皮自基底层向上，着色超出全层下1/3为阳性”的要求考虑了HPV E6/E7蛋白在鳞状上皮黏膜层空间分布的特点，即自基底层至颗粒层表达渐增高［22］。对于诊断CIN2+，4个IHC标志物特异度和AUC值均高于14种hrHPV DNA检测，可能一方面它们比临床最常使用的HPV DNA检测更能体现HPV致癌基因E6/E7的功能状态，另一方面宫颈癌及其癌前病变发病机制中可能存在hrHPV感染以外的其他促肿瘤发生、发展的因素，并调控了这些蛋白的表达。本研究结果显示，FoxM1、Cdc25B与P16及Ki-67均具相关性，尤其FoxM1与Ki-67的相关系数最高，达0.909（P＜0.000 1），且判断CIN2+的灵敏度、特异度和AUC等数据都非常相近，提示细胞核FoxM1蛋白表达可能是与Ki-67相仿的细胞增殖标志物，与其生物学功能符合。Meta分析结果显示，P16在CIN2和CIN3的阳性率分别为68%和82%［23］，本研究CIN2/3中P16阳性率为74%（37/50），与之相仿。P16联合其他标志物后诊断CIN2+灵敏度和NPV均提高。4种蛋白在宫颈CIN和SCC中过表达可能机制兼具共性及差异，由此联合IHC检测可能弥补P16对CIN2/3确诊率的问题。文献报道，至少1/3的CIN1中P16呈阳性［18，23］。目前组织学标本中并不推荐P16单独使用，可用于辅助CIN2/3及其形态学改变相似者的鉴别诊断，而非形态学上明确的正常、CIN1或CIN3病变［18］。故细胞核内FoxM1和Cdc25B蛋白检测结果应同样需结合形态学表现。

综上所述，人宫颈鳞状上皮中细胞核FoxM1和Cdc25B蛋白水平与hrHPV感染相关，有望作为诊断与鉴别诊断CIN2+的潜在辅助指标，其实际临床应用价值仍有待更大样本量临床试验的验证。