经线粒体途径相关信号通路对成骨细胞的影响

张腾 魏鹤翔 张永 吴定 张成俊*

1.兰州大学第二临床医学院，甘肃 兰州 730000

2.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松(osteoporosis，OP)是以骨微观结构改变、骨脆性增加、骨量减少为特征的全身代谢性骨质病变。有关研究表明，老年人及绝经后的妇女是骨质疏松症的高发人群。目前全球多数国家已开始步入人口老龄化，因此研究有关骨质疏松的微观机制及防治药物具有重大的临床意义。

骨质疏松主要受成骨细胞(osteoblast，OB)的凋亡或破骨细胞(osteoclast，OC)的增殖影响发生。导致成骨细胞凋亡的途径中，线粒体凋亡途径是导致成骨细胞凋亡的主要途径。通过线粒体途径及相关通路，可进一步探明骨质疏松的发病机制，便于更好的治疗骨质疏松。

1 线粒体凋亡途径

线粒体是为细胞供能的主要细胞器，为细胞正常活动供应能量、传递信号，参与细胞凋亡等过程。线粒体通透性转位孔(permeability transition pore，PT孔)的开放是引发线粒体凋亡途径的主要原因，PT孔是由线粒体外膜上的阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)和线粒体内膜上的腺苷酸转位因子(adenine nucleotide translocator,ANT)等组成的。PT孔开放后，线粒体内外膜通透性改变，电、化学梯度不能维持，跨膜电位ΔΨm下降，水分进入内膜，导致线粒体基质肿胀，释放出膜间隙的细胞色素C(Cytc)、Smac蛋白(the second mitochondrial derived activator of caspase)和凋亡诱导因子(apoptosis induce factor,AIF)[1-2]。

线粒体释放出细胞色素C后，细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis protease activating factor 1，ApaF-1)结合，位于细胞质中的ApaF-1再与ATP结合改变构象，招募caspase 9前体，caspase 9前体自我剪切活化为有活性的caspase 9蛋白，有活性的caspase 9进一步激活caspase 3，启动caspase级联反应。caspase蛋白可激活CAD(caspase- activated Dnase)，CAD是核酸酶的一种，可引起细胞骨架蛋白和核酸水解，致使细胞凋亡[2]。

从线粒体释放出来的凋亡诱导因子AIF，与细胞色素C和ApaF-1通过caspase级联反应诱导凋亡有所不同，可直接进入细胞核作用于核酸，在相关酶催化下引起DNA大规模断裂和染色质浓缩[4]。AIF可不用caspase蛋白引起凋亡[3]。

Smac蛋白位于线粒体膜间隙中，具有调控凋亡的功能。在线粒体收到凋亡信号时，Smac蛋白进入胞质与凋亡抑制蛋白结合，阻碍其与caspase家族蛋白的结合，从而起到促进凋亡的作用[5，41]。Smac蛋白不能主动引发凋亡，但能促进凋亡。

在通过线粒体途径凋亡的过程中，有一组BcL-2家族蛋白可以参与调控，按功能可分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，促凋亡蛋白主要有Bax、Bak、Bid、Bik等，抗凋亡蛋白有BcL-2、Bcl-xl、Bcl-w等[7,42]。促凋亡蛋白主要通过增加VDAC通透性，抗凋亡蛋白通过与促凋亡蛋白竞争结合相关位点或阻止促凋亡蛋白与相关位点结合来发挥作用[6]。

2 线粒体途径相关信号通路

2.1 PI3K/Akt信号通路

PI3K(phosphatidylinositide 3-kinases)，是一种由调节亚基 p85 和催化亚基 p110 构成的二聚体蛋白质。Akt又称蛋白激酶PKB(protein kinase B)是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，拥有PH结构域。PI3K通路受细胞内外信号调节，当细胞因子等信号刺激受体酪氨酸激酶(RTK)和G蛋白偶联受体(GPCRs)时，胞质区酪氨酸残基活化，p85亚基转移至质膜内表面，磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (phosphatidylinositol 4,5-diphosphate,PIP2)受p110磷酸化变为磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol3,4,5 -trisphosphate,PIP3)[8]，PIP3募集拥有PH结构域的Akt至质膜内面，Akt的Thr308残基被3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 1(PDK1)磷酸化，Ser473残基被哺乳动物雷帕霉素目标复合物(mTORC2)磷酸化，使得Akt被完全激活[9-10]。完全激活后的Akt可作用于GSK-3β、BcL-2家族蛋白、FoxO等的相关基因，调节细胞增殖、凋亡、迁移、生长代谢[19,43]。PI3K信号通路的激活，促进了成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶ALP、BMP-2的表达，有利于成骨细胞的增殖分化[20]。Xue等[40]研究发现，红景天甙可以作用于地塞米松诱导的成骨细胞，可激活PI3K/Akt通路，降低了Bax、细胞色素C、cleaved caspase-3,、cleaved caspase-9的表达，同时提高了BcL-2和p-Akt的表达。

有研究[16]表明，在流体剪切力抑制TNF-α诱导的凋亡实验中，激活PI3K-Akt通路后，Akt活化后降低了caspase-3和Bim的表达，抑制了成骨细胞的凋亡。PI3K-Akt通路通过调控caspase、BcL-2家族蛋白的方法抑制凋亡。除此之外，PI3K还可通过磷酸化GSK-3β，促进β-catenin的堆积，进而增强经典Wnt信号通路[21]，促进细胞增殖。

PI3K通路对成骨细胞的作用主要表现在促进增殖分化和抑制凋亡两方面，在骨组织层面表现为促进骨形成，增加骨量的作用。该通路对治疗骨质疏松方面具有重大意义，而Akt是该通路的核心靶点，故未来可研究作用于Akt的药物来治疗骨质疏松。

2.2 MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一族高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，在细胞的许多生命活动都起了重要作用。MAPK信号传导由MAPKKK、MAPKK、MAPK的三个核心激酶逐层级联化反应组成。其中MAPK信号通路主要有四种，以其组件命名为JNK通路、ERK5通路、p38通路、ERK1 /2通路[11]。

2.2.1JNK通路：Jun氨基末端激酶((c-Jun N-terminal kinase，JNK)是JNK通路的核心物质，关键靶点。JNK的编码基因包括三种：JNK1、JNK2、JNK3。JNK通路可由细胞因子、细胞毒性物质、电离辐射等激活，JNK通路激活顺序一般为ASK1、MEKK1激活MKK4/7，MKK4/7又激活JNKS。JNKS又可以激活部分BcL-2家族成员以及提高早期生长反应因子(early growth response 1，EgR-1)、基环氧酶2(cyclo-oxyge-nase-2，COX-2)、骨桥素和c-fos 的表达[32,44]。Chen[22]等的研究表明，补骨脂素可抑制JNK途径，下调p-ASK、p-JNK、Bax的表达，上调BcL-2的表达来抑制成骨细胞凋亡。Guo等[28]的研究表明，通过LPS激活JNK通路，胞内p-JNK水平提高，提升了Bad和caspase-3的表达，降低了BcL-2的表达，激活caspase-3，诱使成骨细胞自线粒体途径凋亡。JNK不仅是线粒体途径诱发凋亡的关键物质，也可参与诱发内质网途径导致凋亡。阻断JNK通路可显著抑制成骨细胞的凋亡，对治疗骨质疏松有积极意义。

2.2.2p38通路：激活p38通路的物质与JNK相似，由炎性因子(TNFα，IL-1 或 IL-6)及应激刺激(紫外辐射、热或渗透性休克)等刺激。P38通路的激活途径一般由Mlk1-3、MEKK1-4、TAK、ASK1 /2激活MEK3和 MEK6，再由MEK3和 MEK6进一步激活P38。P38 激活后可激活转录因子NF-κB、ATF-2、Elk-1、MEF-2、Stat1、Max、p53 等[23]。Yu等[24]研究表明，地塞米松诱导成骨细胞凋亡的过程中，激活了p38信号通路，用葛根素抑制p38通路，降低p-p38MAPK的表达，可见caspase-3表达下调。此外，彭鎏[35]研究发现，激活的p38 MAPK可引起IκB激酶增加，激活NF-κB信号通路，促进细胞凋亡。Bai等[38]研究表明，在体外用大剂量地塞米松处理成骨细胞，可引起ASK1和p38表达水平升高，激活p38通路，促使成骨细胞凋亡。由此可见，p38通路可以促使成骨细胞凋亡，抑制骨形成，促进骨质疏松的发展进程。研发抑制p38通路的药物有利于预防或治疗骨质疏松。

2.2.3ERK1/2通路：ERK1/2通路受细胞因子、生长因子、激素、渗透压等刺激激活，激活途径是先激活Ras再激活Raf，Raf通过MEK1/2将信号传递给ERK1/2并激活ERK[11]。ERK使许多与胞质胞膜相连的底物c-RaF-1、MEK和磷脂酶A2等磷酸化，且移入胞核可磷酸化一系列促使成骨细胞增殖的转录因子如ELK-1、SAP、AP-1等，促使细胞增殖[33]。HK等[25]研究表明，胶原蛋白水解物可诱使ERK1/2磷酸化，促进成骨细胞的分化增殖。给随后建立了骨质疏松模型的小鼠口服胶原蛋白水解物，小鼠腰椎骨密度上升。Li 等[34]的研究表明，激活ERK1/2后，BcL-2表达下调，Bax表达上调，Bax/BcL-2比值升高，促使细胞凋亡。因此，这一通路对成骨细胞的具体作用存在争议，尚不明确。

2.2.4ERK5通路：ERK5信号通路可由高渗透压、生长因子、流体剪切力、氧化剂等激活。ERK5的激活途径为激活MEKK2/3后，在通过MEK5激活ERK5。Bin等[27]研究表明，流体剪切力通过ERK5途径抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡，活化的ERK进入胞核导致Bad磷酸化，p-Bad被胞质中的蛋白阻隔，进入不了线粒体。通过减少线粒体中的Bad，可以抑制其引起的线粒体途径caspase-3的活化。此外p-ERK5还可激活 p-Akt，减少Bim 的表达，对抗TNF-α导致的凋亡[26]。有关研究往往通过ERK5通路对抗TNF-α等诱导的凋亡。见图1。

2.3 Wnt/β-catenin信号通路

信号通路未被激活时，β-catenin被糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)、Axin、蛋白激酶 1(casein ki-nase 1，CK1)、腺瘤病大肠杆菌(APC)、蛋白磷酸酶2 A(PP2A)等组成的蛋白复合体结合，使β-catenin被定向泛素化，从而被降解[13]。Wnt信号被激活时，与Frizzled和低密度脂蛋白相关蛋白(LRP5/6)等结合，蛋白复合体被磷酸化，招募Axin从而使GSK-3β与蛋白受体复合物分离[14]。β-catenin不能被失去了结合物的GSK-3β磷酸化，β-catenin堆积在细胞中，进入细胞核后与LEF/TCF转录因子家族结合，启动下游靶基因 (如c-myc、Cyclin D1等) 的转录[12,45]。Kang[36]的研究表明，激活后的Wnt/β-catenin信号通路，使BcL-2转录上调，抑制caspase-8及caspase-3活性，抑制细胞凋亡。Wei等[29]在研究敲除了β-catenin基因的小鼠时发现，激活β-catenin可抑制破骨细胞的分化。另有研究[30]表明，可通过Wnt/β-catenin信号通路调节脂肪来源的干细胞促使其向成骨细胞分化。Man等[39]研究发现，熊果苷可提高β-catenin和Runx2的表达水平，激活经典Wnt信号通路，促使成骨细胞增殖分化。

图1 成骨细胞内各相关信号通路、细胞因子经线粒体途径调控细胞凋亡示意图Fig.1 Schematic diagram of regulation of apoptosis by mitochondrial pathway in various related signaling pathways and cytokines in osteoblasts

激活经典Wnt信号通路的主要作用是促进成骨细胞增殖分化[31]，抑制破骨细胞分化，且该通路促使成骨细胞增殖的作用较强，是影响骨量增减的关键通路。而影响该通路的开关因素，就是β-catenin的堆积程度。从这个角度研发针对调节β-catenin的药物可以较好的调节骨量变化。

2.4 NF-κB信号通路

NF-κB是一个核转录因子家族，P50、P52、REL、REL-A和REL-B组成了该家族。该家族成员除REL-B外，均可相互结合形成同二聚体或异二具体。REL-B只可以与p50或p52组成二聚体。通路未被激活时NF-κB通常与IκB结合形成复合物，使NF-κB失去活性。在细胞因子类(TNF-α、IL-1、IL-2)，病度感染及X射线及紫外射线等对细胞施加刺激后，以上刺激激发的第二信使促使IκB降解，NF-κB产生活性。激活的NF-κB转移向核中，选择上调NF-κB1(编码plo5)、NF-κB2(编码pl00)、p Rel、BcL-3 和 MAD3(编码IκBα)等基因[18,46]。彭鎏[35]的研究表明，激活的NF-κB转入核内与Bax基因上的位点结合，促进Bax的表达，从而Bax/BcL-2比值上升，促使细胞凋亡。庞同涛[37]的研究也表明，NF-κB表达增加、通路激活，可使下游的BcL-2表达下调，促进成骨细胞凋亡，抑制增殖。

经典NF-κB通路的激活主要降低成骨细胞的代谢能力，还可通过阻碍Smad蛋白发挥作用来降低成骨细胞的增殖分化能力，促进成骨细胞凋亡为其次要作用。

3 小结与展望

综上，本文介绍了线粒体途径及相关信号通路对成骨细胞的影响。其中，PI3K/Akt、ERK5、Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖分化，JNK通路、P38、NF-κB通路抑制成骨细胞增殖分化。大多信号通路可直接调节线粒体途径中的caspase、BcL-2家族蛋白等关键靶点的调节，从而通过抑制凋亡来促使凋亡，还可通过调控细胞增殖分化过程中的关键物质及其转录因子来影响成骨细胞。

当前有关成骨细胞的研究，仍将细胞的增殖、凋亡等活动笼统地划分在三大途径里。未来有关成骨细胞的研究应更多侧重于各途径信号通路之间的联系影响上，力求将影响成骨细胞增殖、凋亡的各物质包容在一个统一的体系中。在相关疾病的治疗上，深入研究不同药物、激素、胞内外因子作用于各通路关键靶点上的效果，将已有的科研成果转化为临床成果，以解决骨质疏松等病症的治疗问题。