饲粮不同添加量的凝结芽孢杆菌对仔猪生长性能及肠道健康的影响

黄遵锡 程志斌

（1.云南师范大学生命科学学院，云南昆明650222；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

在我国饲料工业全面“禁抗”、养殖业逐步“减抗”的发展态势下，研发饲用微生态制剂、天然植物提取物等安全饲料添加剂及其应用关键技术，以保障畜禽合理的生产性能、减少养殖损失，成为当前我国畜牧科研工作者及企业从业人员的重点工作之一（Barba-Vidal，2018；Liu等，2018；葛长荣等，2019）。微生态制剂凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）2013年正式列入《饲料添加剂品种目录》（程志斌等，2017；夏涛等，2019），因其良好的安全性（Endres 等，2009；Endres等，2011）、耐热性（赵树平等，2014；邹梅等，2017）、抑菌性（Midhun 等，2018；Kawarizadeh 等，2019）等优势，在仔猪饲料替抗应用领域得到了一定的认可与关注（Lan 等，2017；程志斌等，2017；Pu 等，2018；Wu等，2018）。

然而，本课题组分析以往的试验文献报道，前期发表综述（程志斌等，2017），指出了凝结芽孢杆菌在仔猪料应用中的两个尚待解决的问题：其一，与当前商业饲用抗生素相比，在保障合理的仔猪生产性能范围内，确定凝结芽孢杆菌的适合添加量；其二，参考抗生素的作用机理，揭示凝结芽孢杆菌保障断奶仔猪生长性能的可能机理。据此，本试验设计了抗生素组、基础饲粮组，对比研究不同添加量的凝结芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响，并从部分肠道健康指标来探讨其可能的作用机理。

1 材料与方法

1.1 凝结芽孢杆菌

课题组从云南省曲靖市富源县农村散养的地方品种猪“大河猪”肠道中，分离出一株产乳酸的芽孢杆菌，该菌株经过课题组系统的理化分析与16s RNA鉴定为凝结芽孢杆菌，命名凝结芽孢杆菌YNAU 3127，并用于本次动物试验。

1.2 试验动物与试验分组

挑选（26±1）日龄断奶、平均体重约7.5 kg的健康商品阉公猪（杜×长×大）30 头，平均分成5 个处理组，每个处理组6个重复，每个重复1头试验仔猪，代谢笼单笼饲养。试验处理组的分组：①处理组1：抗生素组（antibiotic group，AB），基础日粮中添加组合抗生素（吉他霉素50 g/t、土霉素50 g/t、金霉素75 g/t）；②处理组2：基础饲粮组（antibiotic free group, ABF），即只饲喂基础日粮，且不添加任何抗生素及凝结芽孢杆菌；③处理组3：凝结芽孢杆菌组BC0.5（0.5×107CFU/gBacillus coagulanssupplemented group，BC0.5），在基础日粮中添加0.5×107CFU/g（全价配合饲料）的凝结芽孢杆菌；④处理组4：凝结芽孢杆菌组BC1.0，在基础日粮中添加1.0×107CFU/g 凝结芽孢杆菌；⑤处理组5：凝结芽孢杆菌组BC2.0，在基础日粮中添加2.0×107CFU/g 凝结芽孢杆菌。具体试验分组设计见表1。

表1 试验分组设计

1.3 试验日粮

参照NRC（2012）猪营养需要标准，同时结合云南省猪饲料市场实际情况，配制玉米-豆粕-鱼粉型试验饲粮。试验基础日粮配方及营养水平见表2，颗粒饲料在云南快大多畜牧科技有限公司生产。

表2 试验基础日粮配方及营养水平

1.4 饲养管理

试验期每天3 次喂料，自由饮水，控制试验猪舍合理温度。试验周期为仔猪26～35日龄，共10 d。

1.5 取样及指标测定

试验第10 d，所有试验猪测定体重、采食量，用于平均日增重、平均日采食量、料肉比、腹泻指数等生长性能指标的分析。腹泻指数以笼为统计单元，计算公式如下：腹泻指数(%)=(腹泻猪只数×腹泻天数)÷(猪只数×饲养天数)×100。

随后，处死所有试验猪，取盲肠食糜、空肠及空肠黏膜，进行以下指标测定。

1.5.1 盲肠食糜微生物菌群

盲肠食糜样品取样后，在-20 ℃冰箱中保存。乳酸杆菌与大肠杆菌数量的检测在2个月内完成，检测方法参考课题组前期的报道（黄遵锡等，2017）。

1.5.2 空肠黏膜二胺氧化酶和麦芽糖酶活性

空肠冲洗干净食糜后，取20 cm空肠，用载玻片刮取空肠黏膜，并分成2 份，放置于-20 ℃冰箱中保存。1个月内完成二胺氧化酶和麦芽糖酶活性的测定，二胺氧化酶的检测方法参考Pan 等（2017）的报道，麦芽糖酶的检测方法参考程志斌等（2015）的报道。

1.5.3 空肠绒毛高度与隐窝深度

空肠绒毛高度与隐窝深度的测定参考Che 等（2017）的方法进行，简单描述如下。空肠样品取出后，在甲醛固定液中固定，随后在二甲苯中漂洗，并用石蜡包埋。将包埋好的样品切割出4个5 μm 厚的切片，用苏木红-尹红染色，制成最终切片样品。切片样品在尼康双筒目镜（Warsaw公司，波兰）下，放大20倍，测定绒毛高度和隐窝深度。肠绒毛高度是从隐窝开口至绒毛顶端的距离，隐窝深度是基底层至隐窝开口的距离。每张切片至少连续观察测定20根绒毛的高度及其相应的隐窝深度，并计算平均值。

1.6 统计分析

除了仔猪腹泻指数使用卡方统计外，其他数据进行单因素方差分析和Duncan's 法多重比较。统计软件使用SPSS17.0，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响（见表3）

表3 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响

由表3 可知，与抗生素组（AB）相比，饲喂基础饲粮组（ABF）仔猪的末重、平均日增重显著下降（P＜0.05），而料重比、腹泻指数显著上升（P＜0.05）。与ABF 组相比，饲粮添加凝结芽孢杆菌的BC1.0 组和BC2.0组仔猪的末重、平均日增重显著增加（P＜0.05），腹泻指数显著下降（P＜0.05）。BC1.0 组和BC2.0 组仔猪各项生长性能指标，与AB组差异不显著（P＞0.05）。

2.2 凝结芽孢杆菌对仔猪盲肠食糜乳酸杆菌和大肠杆菌菌群数量的影响（见图1）

由图1可见，与AB组相比，ABF组仔猪盲肠食糜的乳酸杆菌数量显著降低（P＜0.05），大肠杆菌数量显著上升（P＜0.05）。与ABF 组相比，BC1.0 组和BC2.0 组仔猪盲肠食糜的乳酸杆菌数量显著增加（P＜0.05），大肠杆菌数量显著减少（P＜0.05）。BC0.5组、BC1.0 组和BC2.0 组仔猪盲肠食糜的乳酸杆菌数量，与AB 组仔猪差异不显著（P＞0.05）；BC2.0 组与AB 组仔猪盲肠食糜的大肠杆菌数量，差异不显著（P＞0.05）。

2.3 凝结芽孢杆菌对仔猪空肠黏膜二胺氧化酶、麦芽糖酶活性的影响（见图2）

图1 凝结芽孢杆菌对仔猪盲肠食糜乳酸杆菌（A）、大肠杆菌（B）菌群数量的影响

图2 凝结芽孢杆菌对仔猪空肠黏膜二胺氧化酶（A）、麦芽糖酶（B）活性的影响

由图2可见，与AB组相比，ABF组仔猪空肠黏膜的麦芽糖酶活性显著降低（P＜0.05）。与ABF 组相比，BC1.0 组和BC2.0 组仔猪空肠黏膜的麦芽糖酶活性显著增加（P＜0.05）。BC1.0 组和BC2.0 组仔猪麦芽糖酶活性与AB 组差异不显著（P＞0.05）。此外，所有处理组之间空肠黏膜二胺氧化酶的活性差异不显著（P＞0.05）。

2.4 凝结芽孢杆菌对仔猪空肠绒毛高度、隐窝深度的影响（见图3）

由图3可见，与AB组相比，ABF组仔猪空肠的绒毛高度显著下降（P＜0.05）。与ABF组相比，BC0.5组、BC1.0 组和BC2.0 组仔猪空肠绒毛高度显著增加（P＜0.05）。BC0.5组、BC1.0组和BC2.0组仔猪空肠绒毛高度与AB 组差异不显著（P＞0.05）。此外，所有处理组之间的空肠隐窝深度差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

图3 凝结芽孢杆菌对仔猪空肠绒毛高度（A）、隐窝深度（B）的影响

据课题组前期发表的综述文献（程志斌等，2017）显示，现有关于凝结芽孢杆菌改善断奶仔猪生长性能的绝大多数试验报道（周映华等，2012；黄海强，2014；Wu 等，2018；张越等，2018），其参照的对照组是无任何饲料添加剂的基础饲粮组（ABF），这显然很容易得出凝结芽孢杆菌添加的正效应，包括本课题组前期报道（余冬友等，2017）和本试验数据（见表3）均验证了这一观点。因此，本研究才进一步设计了抗生素组（AB组），所饲喂的抗生素（吉他霉素50 g/t、土霉素50 g/t、金霉素75 g/t）是近3 年来我国饲料企业最常用的仔猪饲用抗生素方案（黄遵锡等，2017）。本研究目的在于评估凝结芽孢杆菌替抗的适合添加量及作用效果。

3.1 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响

表3结果显示：与ABF组相比，3个补充凝结芽孢杆菌组的仔猪生长性能均有较大改善，尤其是BC1.0组和BC2.0组仔猪生长性能更优异，这与课题组前期报道（余冬友等，2017）及张越等（2018）的结论基本一致。而且，本试验首次发现，补充(1.0～2.0)×107CFU/g凝结芽孢杆菌的BC1.0组和BC2.0组仔猪各项生长性能指标，与抗生素组仔猪差异不显著。以上结果表明：本试验条件下，日粮补充大于1.0×107CFU/g 高添加量的凝结芽孢杆菌，能够使断奶仔猪获得与饲用抗生素较为接近的生长性能；而0.5×107CFU/g 低添加量的凝结芽孢杆菌饲喂效果，略低于抗生素效果。这些结果提示，凝结芽孢杆菌改善断奶仔猪生长性能的作用有明显的剂量效应，其机理可能与维持肠道健康的程度有关（Jäger 等，2018；Pluske 等，2018）。据此，本试验进一步分析了以下肠道健康的部分指标。

3.2 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪盲肠食糜菌群的影响

肠道菌群平衡是肠道健康的基础（Gresse 等，2017；Li 等，2017），因此本研究首先分析了凝结芽孢杆菌对仔猪盲肠食糜乳酸杆菌和大肠杆菌菌群数量的影响（图1）。结果显示：与AB 组相比，ABF 组仔猪盲肠食糜的乳酸杆菌数量显著降低、大肠杆菌数量显著上升，这是抗生素抑菌改善肠道健康、提高断奶仔猪生产性能的重要机理之一（Li等，2017）。随着饲粮中凝结芽孢杆菌添加量的增加，仔猪盲肠食糜的乳酸杆菌数量逐步增加、大肠杆菌数量显著减少，这一结果与张越等（2018）的结论基本一致。进一步分析，本试验首次发现：添加2.0×107CFU/g 凝结芽孢杆菌的仔猪盲大肠杆菌数量与抗生素组差异不显著。这一结果表明，本试验创新筛选并用于动物试验的凝结芽孢杆菌，对革兰氏阴性大肠杆菌的抑制效果较好，具有显著的体内抑菌特性。以往更多的试验报道均显示（Midhun 等，2018；Kawarizadeh 等，2019）：凝结芽孢杆菌在体外实验室培养条件下，对有害大肠杆菌具有显著的抑制作用；但这一体外抑菌效果并未在动物饲喂试验（体内）中与抗生素抑菌效果进行比较验证，而本研究首次弥补了这一空白。

3.3 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪空肠黏膜麦芽糖酶、二胺氧化酶活性的影响

麦芽糖酶是仔猪肠上皮细胞合成并分泌进入肠腔，用于分解食糜中二糖、三糖的关键酶之一（程志斌等，2015；Xiong等，2019）。由于仔猪肠上皮细胞只能以各种单糖的形式摄入饲料碳水化合物，因此麦芽糖酶对仔猪碳水化合物的营养有关键调控作用，所以麦芽糖酶经常用于反映幼龄仔猪肠道的发育（程志斌等，2015）和（或）损伤程度（蒲俊宁等，2018）。图2结果显示：日粮补充（1.0～2.0）×107CFU/g凝结芽孢杆菌的仔猪空肠黏膜的麦芽糖酶活性，与抗生素组差异不显著，且均高于饲喂基础饲粮的仔猪。这一结果表明：凝结芽孢杆菌与抗生素均有利于维护肠道机械屏障的完整性，有助于保障断奶仔猪的肠道健康。众所周知，肠道大肠杆菌、尤其是致病大肠杆菌所分泌的毒素、崩解的脂多糖等多种有害物质，极易破坏肠黏膜上皮细胞，造成肠上皮渗透性增加，肠道机械屏障完整性受损（Gresse等，2017；Luise等，2019）。结合图1的肠道菌群数据，以上结果证明：日粮补充凝结芽孢杆菌能够通过抑制肠道有害菌及其可能的有害代谢产物，来减少对断奶仔猪肠道上皮细胞的损伤，且这一作用有明显的剂量效应。

此外，二胺氧化酶活性也经常用于评估肠道机械屏障的完整性，即判断肠黏膜损伤程度（Pan 等，2017；Wu 等，2018），因为二胺氧化酶与上皮细胞内的核酸和蛋白合成密切相关，是上皮细胞损伤修复与更新的关键调控酶之一（Wu 等，2018）。然而，本试验结果显示（见图2）：空肠黏膜二胺氧化酶活性，所有处理组之间差异不显著。我们推测本试验条件下，空肠黏膜二胺氧化酶活性差异不显著的可能原因包括：其一，在本实验室饲养试验环境卫生控制很好的情况下，所有试验仔猪肠黏膜的损伤程度在可接受的范围内，且二胺氧化酶的活性数值较小，这就造成活性数据统计上的差异不显著。其二，就反映肠黏膜正常生理和（或）损伤程度而言，可能二胺氧化酶不如麦芽糖酶敏感，因为麦芽糖酶的活性数值较大。

3.4 凝结芽孢杆菌对断奶仔猪空肠绒毛形态的影响

仔猪肠黏膜上皮细胞来源于隐窝处干细胞的分裂、增殖、增生和逐步向绒毛顶端的迁移，细胞在迁移过程中逐步完成功能的成熟，这些功能包括正常的消化、吸收和分泌等功能（Ji等，2019），由此绒毛高度显示肠上皮细胞的功能状况，而隐窝深度则更加反映上皮细胞的增殖和损失更替状况（Chen 等，2019）。因此，测定肠绒毛高度、隐窝深度是评估幼龄仔猪肠道发育和功能成熟（程志斌等，2015；Ji等，2019）以及损伤修复（Che等，2017；Pan等，2017）的重要标志。图3结果显示：抗生素组仔猪绒毛高度显著大于基础饲粮组，也验证了抗生素组仔猪肠道营养消化与吸收功能优于基础饲粮组（Li 等，2017），这与表3 抗生素组仔猪生长性能优于基础饲粮组的结果相符。进一步分析，补充凝结芽孢杆菌的3个处理组仔猪绒毛高度与抗生素组差异不显著，结合图1 肠道菌群的数据，充分证明：凝结芽孢杆菌具有减少肠道有害菌对肠黏膜的损伤，维持断奶仔猪肠道健康的重要作用（Jäger等，2018），且这一作用效果与抗生素相近；这是本研究高添加量凝结芽孢杆菌改善断奶仔猪生长性能的重要作用机理。此外，图3发现所有处理组之间的空肠隐窝深度差异不显著，表明本试验条件下所有试验仔猪肠黏膜可能只发生轻微损伤，这也与图2反映肠道损伤程度的二胺氧化酶活性结果相符。

4 结论

正常养殖环境条件下，断奶仔猪无抗日粮补充凝结芽孢杆菌，具有显著提高生长性能的作用效果，且这一效果有显著的剂量效应。实际饲料配方应用中，添加(1.0～2.0)×107CFU/g的凝结芽孢杆菌才能获得与商业抗生素相近的饲喂效果，其作用机理与足量添加的凝结芽孢杆菌才能有效保护肠道健康有关。