天然油中游离谷氨酸、游离酪氨酸的含量测定

□ 柯粤振 伍 蓥 续 颖 李逸纯 广东美味鲜调味食品有限公司

天然油发酵是酱油生产过程中的重要工序，向成曲中加入一定量的水或者盐水，经搅拌后装入发酵容器中，并保持一定的温度，利用微生物和微生物所分泌的各种酶将复杂的有机物分解成简单的有机物的生化变化过程即为天然油发酵过程，酱油独特的风味就是在发酵和老化过程中逐渐形成的[1]。

天然油发酵过程中会形成大量游离氨基酸[1]，游离氨基酸的产生使酱油具有特有的风味[2—3]，其中游离谷氨酸是主要的鲜味物质[2—4]，能赋予酱油鲜美的味道，准确测定天然油中游离谷氨酸的含量对酱油营养价值的提升具有积极意义。同时在天然油发酵过程中也会析出一种白色的物质附着在豆粒的表层，并逐渐形成圆形或片状的白色颗粒，俗称“白点”[5]，它的存在严重影响了产品的外观。这些白点以酪氨酸为主，由多种氨基酸共同结晶而成[6]，准确测定天然油中游离酪氨酸的含量对改良酱油品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基酸标准品(2.5 μmol/mL)：美国sigma公司；三氯乙酸：分析纯；缓冲液 B1、B2、B3、B4、B6：日本日立公司；茚三酮溶液R1、R2：日本日立公司；盐酸：优级纯。

1.2 仪器和设备

L—8900全自动氨基酸分析仪：日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

准确吸取1 mL混合均匀的天然油于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的HCl稀释定容至50 mL，摇匀。再取2 mL稀释液于5 mL离心管中，加入2 mL 1%三氯乙酸溶液去除蛋白质，10 000 r/min离心5 min，离心后上清液过0.22 μm滤膜进样分析。

1.3.2 标准曲线的绘制

将氨基酸标准品（2.5 μmol/mL）用0.02 mol/L盐酸溶液稀释至0.1 nmol/μL 与 0.25 nmol/μL 的标准溶液，上机测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，强制过原点，绘制标准曲线。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：日立钠离子交换树脂4.6 mm×60 mm；测定波长：570 nm和440 nm；柱温：57 ℃；进样体积：20 μL；流动相按梯度表（表 1）进行洗脱。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

对1.3.2方法配制的标准溶液上机测定，分别绘制谷氨酸、酪氨酸标准曲线（图1、图2），强制过原点后相关系数r2均大于0.999，说明在测定范围内线性关系良好。氨基酸标样色谱图（见图3），出峰时间为30 min，所有氨基酸都得到了良好的分离，其中谷氨酸、酪氨酸的保留时间分别为6.813 min和18.287 min。

图1 谷氨酸标准曲线

图2 酪氨酸标准曲线

图3 氨基酸标样色谱图（0.1 nmol/μL）

2.2 精密度

准确吸取天然油样品6份，在相同条件下进行样品处理和进样分析，根据测定结果计算变异系数，结果（见表2），酪氨酸、谷氨酸的CV均小于2%，表明方法的重现性较好。

表2 天然油平行测定6次结果

2.3 加标回收率

将一定量标样加入到天然油样品中，然后与未加标样的天然油平行进行前处理和进样分析，根据酪氨酸、谷氨酸的测定值、计算回收率，结果（见表3），酪氨酸、谷氨酸回收率均在90%以上，说明测定结果较准确，该方法可以用于天然油中游离酪氨酸、游离谷氨酸的定量分析。

表3 酪氨酸、谷氨酸回收率

2.4 样品的测定

采用本方法测定天然油样品，色谱图（见图4），测定结果（见表4），酪氨酸、谷氨酸与其他组分分离良好，峰型好，干扰小。说明本方法比较适合测定天然油中的游离酪氨酸、游离谷氨酸的含量。

图4 天然油游离氨基酸色谱图

表4 天然油游离谷氨酸、游离酪氨酸测定结果

3 结论

本方法采用三氯乙酸去除天然油中蛋白后，用自动氨基酸分析仪测定游离酪氨酸与游离谷氨酸的含量，操作简单、重现性好、回收率高、干扰小，是准确快速测定天然油中游离酪氨酸、游离谷氨酸的可靠方法。本方法对酱油工艺改良、品质提升的研究具有重要意义。