峨眉山野生金蝉花孢梗束培养试验

李燕秋， 贺小丽， 庄在非， 贺新生

(西南科技大学生命科学与工程学院 生物工程系，四川 绵阳 621010)

金蝉花Cordycepscicadae(Hill ex Watson) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora, in Sung, Hywel-Jones, Sung, Luangsa-ard, Shrestha & Spatafora,Stud.Mycol.57: 46 (2007)。分类学地位属于真菌界，子囊菌门，盘菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌亚纲，肉座菌目Hypocreales，线虫草科，线虫草属。金蝉花在药用和食疗等方面具有显著成效，是我国三大虫生真菌之一。最新研究表明，金蝉花具有提高免疫力、解热镇痛、改善睡眠以及抗肿瘤、抗辐射、降血糖等重要作用[1-3]，适宜免疫力低下和身体亚健康等人群。随着野生金蝉花资源的日趋减少，人工培育金蝉花显得尤为重要。人工培育的金蝉花中人体必需氨基酸、蛋白质等有效成分含量超过野生金蝉花[3-5]，人工培育的金蝉花所具有的保健效果比野生金蝉花更好，且人工培育的金蝉花所受限制少许多，能大规模的产出[3]，可以作为新的保健品进行开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 金蝉花(Cordycepscicadae)XKD-1，原始标本采自四川省峨眉山后山竹林，通过分生孢子分离、纯化得到纯菌种，菌株保存在西南科技大学生命科学与工程学院微生物学实验室。

1.1.2 供试材料 马铃薯、麸皮、大米、小米、玉米、小麦、黄豆、绿豆、红豆。

1.1.3 培养基 查阅文献选用蛋白胨-葡萄糖-酵母膏培养基、可溶性淀粉-酵母膏培养基、玉米粉-酵母膏培养基、PDA培养基、 Richard培养基、Czapek培养基[6]6种琼脂培养基配方。其中非常规培养基配方：①蛋白胨-葡萄糖-酵母膏培养基：蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,酵母膏1 g；②可溶性淀粉-酵母膏培养基：可溶性淀粉15 g,酵母膏4 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g； ③玉米粉-酵母膏培养基：玉米粉10 g,酵母膏1 g,蔗糖5 g。

1.1.4 试剂及仪器设备 蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、KCl、FeSO4，本研究所用试剂均为化学纯；高压灭菌锅(DT-8L，山东德天环保设备有限公司)，大容量电热恒温培养箱(DHP-1000，一恒仪器)，超净工作台(DL-CJ-1NDII，北京东联哈尔仪器)。

1.2 方法

1.2.1 琼脂培养基配方的筛选 取各配方培养基25 mL于100 mL三角瓶中，用封口膜密封，121 ℃灭菌30 min。待培养基表面冷凝水较少后将金蝉花分生孢子在培养基表面接种。25 ℃恒温培养，菌丝完全覆盖培养基后转为室温培养，重复5次。观察记录孢梗束的发育时间以及生长状况。

1.2.2 天然原料单因素试验 用天然原料大米、小米、玉米、黄豆、绿豆、红豆各20 g装入450 mL聚丙烯盒中，各加水20 mL，封口灭菌接种培养，各重复6次。

1.2.3 天然原料均匀设计法优化配方试验 对大米、小米、玉米等6种原材料采用均匀实验设计的方式进行配方设计(见表1)。按配方配制各参数质量减半的培养料，用300 mL的聚丙烯盒装料，每盒装30 g干料，料水比为1∶ 1，封口膜封口后灭菌，待培养基冷却到室温后接种培养。每组培养基重复6次。当培养料表面被菌丝覆盖满3～5 d后，将培养基转移至室温培养，足够的昼夜温差刺激孢梗束发育。观察记录菌丝的生长速度、金蝉花孢梗束发育的时间和孢梗束的生长状况。

表样品均匀设计表

1.2.4 成分含量测定 委托上海市农业科学院农业部食用菌质量监督检验测试中心对孢梗束中蛋白质、氨基酸、粗多糖、腺苷、虫草酸等成分进行测试。

2 结果与分析

2.1 琼脂培养基中金蝉花菌丝体和孢梗束生长的情况

试验结果见表2，培养基组分不同对金蝉花的菌丝长速以及孢梗束的生长存在明显差异，培养基营养成分的不同直接影响金蝉花孢梗束的产生和生长。以天然原料作为主要营养成分时，菌丝覆盖率较高，但均无金蝉花孢梗束产生。无机盐作为主要营养成分时，菌丝生长速度较快，菌丝覆盖率均较低，菌丝后期颜色为黄色，比天然原料作为主要营养成分时较深，但均有孢梗束的产生。在实际工厂生产应用中，采用无机盐配方成本较高，操作繁琐。因而考虑对其他有机物进行试验，探究其能否培育出金蝉花孢梗束。

2.2 天然原料单因素试验

由表3可以看出，当以大米为主要营养物质时，金蝉花孢梗束出芽时间最快，10 d就可以长出金蝉花孢梗束，孢梗束生长速度最快，为1.0 mm/d，培育出的金蝉花孢梗束高度最高，为12 cm，品相最好，呈针状，培育出的金蝉花孢梗束数量最多，适合工业化培养。以豆类为主要营养物质的金蝉花培养基培育出的金蝉花出芽时间都较长，金蝉花孢梗束成团簇状或树杈状生长，并且孢梗束较少，高度较低，不适于工业化培养。

表2 常用金蝉花培养基对金蝉花菌丝体和孢梗束生长的影响Table 2 Effect of commonly used culture medium of Cordyceps cicadaeon the growth of mycelium and fasciculus of Cordyceps cicadae

表3 单因素金蝉花生长情况

2.3 均匀设计配方的优化试验

均匀设计试验结果见表4，由优化后的实验结果可以看出10号培养基试验为最好。不同营养物质组合的培养基对金蝉花产孢梗束时间以及孢梗束形状等影响较大。根据表4可得到以下结论：①除11号配方和6号配方以外，金蝉花孢梗束产生时间基本在20 d左右；②孢梗束产生后20 d左右开始产孢子，菌体生长状况稳定；③菌体培养过程中，约50%的金蝉花出现菌丝贴壁状况，且6号配方、12号配方金蝉花菌丝贴壁严重；④天然原料混合的培养基培养的金蝉花孢梗束相较于单一原料的培养基培养出的金蝉花孢梗束更矮，并且混合培养基培养的金蝉花孢梗束更宽；⑤混合培养基培养的金蝉花孢梗束形状主要以珊瑚状和团簇状为主，针状孢梗束少；去掉整齐可比性，对实验数据进行回归分析，结果见表5。

回归方程：y=-0.013+0.007×玉米-0.020×小米+0.050×红豆-0.034×绿豆+0.038×大米+0.047×黄豆。其中红豆和黄豆比较P<0.05，有显著性差异，表示自变量红豆和黄豆对因变量收率的解释力或预测力正相关。

分析标准化系数Beta值可得，红豆对收率影响最大，玉米对收率影响最小。

2.4 混合配方中金蝉花孢梗束形态的多样性

由于培养基中物质组成不同，金蝉花呈现不同的孢梗束形态，主要孢梗束形态为珊瑚状，即孢梗束成簇生长，该形态的孢梗束产量较高，采收方便。珊瑚状的孢梗束比其他形态的金蝉花孢梗束更易产生孢子，并且珊瑚状的孢梗束形态多变。

表4 优化试验结果

表5 变异数分析

表6 回归系数结果

以大米为主要营养物质的配方中金蝉花孢梗束呈现针尖状，菌体形态较好。在后续的培养过程中发现该种形态的孢梗束产生的孢子主要集中在针尖，并且较其他形态的孢梗束而言，针尖状孢梗束产孢子较晚，孢子少。

部分培养基上会长出团状和花菜状两种形态的孢梗束。团状孢梗束在生长前期是白色的菌丝团；生长中期会长出较短、较小的金蝉花孢梗束；随着后续的培养，菌丝团上面的孢梗束并不会长大，但是会增多。一般来说，一种培养基里可能出现3～4个团状的孢梗束。在最后的孢梗束采收时发现团状的孢梗束内部几乎全是孢子。

花菜状孢梗束形态和团状孢梗束类似，区别在于花菜状孢梗束在生长过程中一直处于菌丝团的形态，并不会产生明显的孢梗束，在生长后期，菌丝团的顶部会冒出类似于孢梗束的芽状物质。花菜状孢梗束均较大。

树枝状孢梗束在培养过程中比较少见，树枝状孢梗束在培养前期呈厚片状生长，中期逐渐呈树枝状分叉生长，后期孢子布满整株孢梗束。

在培养过程中发现，除孢梗束形态不同以外，金蝉花孢梗束的产生和生长情况随培养环境变化而变化，在转入罐头瓶培养后，金蝉花孢梗束贴壁生长情况比在锥形瓶培养更严重，可能原因是罐头瓶中的空间更大。孢梗束贴壁生长分为两种情况：一种是金蝉花培养前期菌丝贴壁生长，之后转为片状孢梗束贴壁生长；另一种是金蝉花菌丝贴壁后转为片状孢梗束，其顶部长出针状孢梗束。

除此之外，金蝉花孢梗束在不同的培养基中往往呈现孢梗束混杂生长的情况，在混合培养基中，金蝉花通常呈现两种或者三种孢梗束形态。

图1 孢梗束形态多样性Fig.1 Morphological Diversity of pedicel bundlesA：珊瑚状孢梗束；B：珊瑚状孢梗束产孢；C：针状孢梗束；D：针状孢梗束产孢；E：团状孢梗束；F：花菜状孢梗束；G：树枝状孢梗束；H：树枝状孢梗束产孢；I：菌丝贴壁后转为片状孢梗束贴壁；J：菌丝贴壁后长针状孢梗束；K：孢梗束形态混杂；L：孢梗束形态混杂A： coralliform fasciculus; B： coralliform fasciculus sporulation; C： acicular fasciculus; D： acicular fasciculus sporulation; E： agglomerate fasciculus; F： cauliflower fasciculus; G： dendrimer fasciculus; H： dendrimer fasciculus sporulation; I： the hypha adheres to the wall and then turns to the lamellar fasciculus; J： the hypha adheres to the wall and then the long acicular fasciculus; K： The fasciculus morphology is mixed; L： the fasciculus morphology is mixed

2.5 孢梗束成分分析

根据上述实验后得到的孢梗束形态和数量来看，大米培养的孢梗束形态最好，10号样品培养出来的孢梗束干重最重，小麦培养的孢梗束形态均为珊瑚状且数量较多。将这3份孢梗束送往上海农科院对虫草酸、粗多糖、粗蛋白、氨基酸、腺苷等物质进行检测分析。大米培养的金蝉花孢梗束为1号样本，10号样品培养的金蝉花孢梗束为2号样本，小麦培养的金蝉花孢梗束为3号样本。

由表7可以看出，实验室培育出的金蝉花孢梗束中蛋白质含量均比野生金蝉花孢梗束中蛋白质含量高，其中2号、3号样品中蛋白质含量分别高出22.9%、23.9%；3个样品中氨基酸含量都明显高于野生金蝉花中氨基酸含量，其中3号孢梗束中氨基酸含量高达35.2%，比野生金蝉花中氨基酸含量高出近1倍。1号金蝉花粗多糖与野生金蝉花粗多糖含量相近，2号及3号金蝉花中粗多糖含量明显低于野生金蝉花中粗多糖的含量。1号、3号金蝉花中腺苷的含量与野生金蝉花中腺苷含量相近，2号金蝉花中腺苷含量则明显低于野生金蝉花中腺苷含量。

表7 实验室金蝉花与天然金蝉花成分分析

由图2可以看出，发酵金蝉花中氨基酸种类与野生金蝉花中氨基酸种类相同，并无缺失的氨基酸。发酵金蝉花中人体必需的氨基酸比例远高于野生金蝉花，其中2号孢梗束中人体必需氨基酸含量最高，可达12.31%，比野生金蝉花高出6.66%。发酵金蝉花中，天冬氨酸、酪氨酸和脯氨酸这3种对人体生理有积极影响的氨基酸含量远高于野生金蝉花中该类氨基酸的含量。

图2 金蝉花孢梗束中氨基酸种类及含量对比图Fig.2 Comparison of amino acid types and contents in pedicel of Chrysosporium

3 讨 论

金蝉花琼脂培养基单一培养物最适合用大米。选用大米作为单一营养物质来源时最先长出金蝉花孢梗束，金蝉花孢梗束数量最多，菌体形态最好，整体呈针尖状直立生长，孢梗束生长速度最快，适合进行规模化培养。

金蝉花琼脂培养基混合培养物以大米与玉米为主。在混合培养基配方中，出现原基最快的有1号、2号、5号和12号，其中 10号孢梗束长速较快，产孢子时期较晚。从菌体形态上分析，10号混合培养基中培养的金蝉花孢梗束数量较多，孢梗束呈珊瑚状生长，菌体形态较好，孢梗束成熟快，方便收集和利用，更适合工业生产与采收。

金蝉花孢梗束形态多变性与培养环境有关。培养过程中发现，由于培养基的组成以及培养环境条件的不同，金蝉花孢梗束表现出不同形态，相同形态的孢梗束在不同的培养批次中也会表现出不同的形态。综合实验操作以及培养条件分析，影响金蝉花孢梗束形态的因素包括温度、培养基种类、培养时的光照等，希望通过后续的实验总结得出金蝉花孢梗束形态多变的影响因素。

金蝉花中有效成分含量与其原料种类和数量有关。发酵金蝉花孢梗束中虫草酸含量较野生低，蛋白质、氨基酸等活性物质的含量远高于野生金蝉花。1号金蝉花子实中氨基酸略高于野生金蝉花中氨基酸的含量，蛋白质也相较于野生的金蝉花低，粗多糖以及腺苷的含量与野生金蝉花相近，虫草酸的含量低于野生金蝉花。2号混合培养基培养的金蝉花孢梗束中氨基酸和蛋白质远高于野生金蝉花，但虫草酸、粗多糖和腺苷的含量远低于野生金蝉花。3号金蝉花孢梗束中氨基酸和蛋白质远高于野生金蝉花，虫草酸和腺苷的含量与野生金蝉花相持平，粗多糖的含量远低于野生金蝉花。

在试验过程中发现，金蝉花在6～35 ℃范围内均可生长，10～20 ℃温度范围内孢梗束生长情况最好，湿度要求并不高，在进行大规模培养时对湿度的调整与控制要求不高，由于在锥形瓶中接近于密封培养，因而对通气量要求低，在空气不流通的情况下也能很好生长。

由于金蝉花孢梗束形态的多变性，即使是同种培养基也可能产生不同形态的孢梗束，并且同种形态的孢梗束随着培养时间的变化也有可能发生变异等情况。由于金蝉花产率和收率与孢梗束形态有着密不可分的关系，因而希望通过控制孢梗束的形态来提高金蝉花的产率和收率。

近年来，金蝉花的工艺化培养受到人们的广泛关注，市场上虽然存在金蝉花规模化培养，但对金蝉花的应用更缺乏深入的研究。目前为止，国内对金蝉花的研究仅限于对金蝉花中提取的多糖等成分进行药理作用的分析和金蝉花对人体的相关影响，以及在中药配方的应用[6，9]。而人工栽培金蝉花主要是依靠液体发酵蝉拟青霉菌丝体[10]和人工培养固体金蝉花孢梗束两种技术，以水稻、小麦等为发酵基质基本实现金蝉花的栽培[11]。

今后应在实现固体小规模培养的基础上，在大容器里培养金蝉花，使金蝉花孢梗束大量繁殖，易于控制，利用液体菌种培养金蝉花，因为液体菌种培养更易于完成，染菌机率也大大降低，在菌种收集上有更大的优势，易形成流水线工厂化生产。