发酵虫草菌粉对慢性疲劳大鼠行为及ACTH、CORT的影响

郭智宽 田 捧

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一组临床表现为持续时间大于6个月的体力、脑力疲劳，同时伴有肌肉痛、关节痛、头痛及情绪低落、失眠、抑郁等心理精神症状的综合征[1]。在古代中医药著作中尚未发现慢性疲劳综合征的病名，根据CFS的临床表现，其应属于“虚劳”“郁证”“内伤发热”等范畴。多数中医学者认为其病位以肝、脾、肾为主，发病多因思虑、劳作过度或外邪侵袭致肝、脾、肾受损致使肝失疏泄，脾失运化，肾气不充而导致气血阴阳亏虚，从而引发本病。冬虫夏草性温味甘；归肾、肺经；具有补肾益肺，止血化痰的功效。发酵虫草菌粉胶囊系从青海冬虫夏草中分离所得的虫草拟青霉CS-4菌株，经纯化、人工发酵培养加工制成的口服制剂。与天然虫草有着类似的化学成分和药理作用。我们前期临床观察中发现发酵虫草菌粉胶囊对CFS患者有比较好的疗效[2]。但其对CFS治疗的作用机理尚不明确，鉴于此，我们在以往的研究基础上，用慢性疲劳大鼠动物模型来观察发酵虫草菌粉胶囊对CFS的治疗作用，从而探讨其作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物SPF级成年雄性SD健康大鼠72只，体质量(200±20)g,由河南省实验动物中心提供(许可证号：SCXK豫2005-0001)。

1.1.2 动物饲料大鼠标准饲料，由河南省实验动物中心提供(许可证号：SCXK豫2005-0001)。

1.1.3 实验药品发酵虫草菌粉(金水宝)胶囊由江西济民可信药业有限公司制造，国药准字Z10890003，规格：0.33 g/粒；苁蓉益肾颗粒由内蒙古兰太药业有限责任公司制造，国药准字Z20030099，规格:2 g/袋。

1.1.4 实验试剂及仪器促肾上腺皮质激素放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所；碘[125I]皮质醇放射免疫分析药盒购自北京北方生物技术研究所；Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所生产)；SN-682型放射免疫γ计数器(上海核福光电仪器有限公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组正常喂养1周，72只大鼠自然饮食，在室内光照，温度(20±1)℃，相对湿度40%的环境中，6只/笼，适应性饲养1 周后将SD大鼠72只采用统计软件进行随机分组，分为正常组、模型组、发酵虫草菌粉高、中、低剂量组、苁蓉益肾颗粒组，每组12只。

1.2.2 造模方法造模之日起，除正常组外，其余大鼠根据文献报道[3,4]的睡眠剥夺+负重力竭游泳方法建立复合因素致慢性疲劳大鼠模型。睡眠剥夺方法：向鼠笼内注入1.5 cm深的水，将大鼠放入其中盒盖上放置饲料和水，使大鼠能够自由进食饮水。每日于13:00将大鼠放入，次日9:00将大鼠取出，睡眠剥夺共20 h；负重力竭游泳方法：睡眠剥夺后，每日9:00进行负重力竭游泳训练，将负重其身体质量的5%的大鼠放入水深50 cm的游泳池内，水温(25±1)℃，使其游泳至力竭，头部没入水中10 s无法浮出水面即判定为力竭状态。

1.2.3 大鼠学习记忆能力及游泳速度测试方法采用Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)，规格：直径150 cm，高60 cm，内设一低于水面的圆柱形平台直径9 cm，水深以高过平台2 cm为度，造模前2 d将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序依次放入水迷宫实施训练，造模前1天进行水迷宫测试，将大鼠从2个固定点入水到找到平台所需的平均时间，作为大鼠学习成绩。造模结束后第1天再次测试各组大鼠水迷宫实验找到平台所需的时间，作为大鼠的记忆成绩。在测时间的同时检测大鼠游泳速度。

1.2.4 鼠尾悬挂实验将大鼠尾端2 cm的部位粘贴在一水平板上(使板离地1 m)，使动物呈倒挂状，计算6 min内的不动时间。造模前1 d和造模结束后1 d分别测试1次。

1.2.5 给药方法从造模第14天开始，正常组正常饲养，模型组给予生理盐水灌胃，3 ml/只；苁蓉益肾颗粒组按417 mg·kg-1·d-1给予苁蓉益肾颗粒灌胃，3 ml/只；发酵虫草菌粉组高、中、低剂量组分别按1238 mg·kg-1·d-1，619 mg·kg-1·d-1，309 mg·kg-1·d-1(药物剂量按等效剂量的直接折算法计算，309 mg·kg-1·d-1相当于人临床剂量的等效量)给予发酵虫草菌粉混悬液灌胃，3 ml/只。各组大鼠给药均1次/d，连续14 d。

1.2.6 标本制作方法

1.2.6.1 检测ACTH标本的采集及检测实验结束后，用10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠后，打开腹腔，从腹主动脉取血2 m1收集到加有10%EDTA-2Na30 μl和抑肽酶20 μl的试管中，混匀于离心机4 ℃、3000 rpm离心10 min，分离血浆放置冰箱冷冻(-20 ℃)中保存待测ACTH。冰冻样品测定前，使样本置于室温中复融，再次4 ℃、3000 rpm离心5 min,取上清测定。检测时按照试剂盒说明书方法进行检测。

1.2.6.2 检测CORT标本的采集采血方法同上。检测时按照试剂盒说明书方法进行检测。

2 结果

2.1 鼠尾悬挂实验造模前各组大鼠6 min间断不动时间无统计学差异(P>0.05)；造模后，与正常组比较，模型组大鼠6 min不动时间明显延长，差异有极显著性意义(P<0.01)；与模型组比较，发酵虫草菌粉高、中、低剂量组及苁蓉益肾颗粒组6 min不动时间缩短，差异有极显著性意义(P<0.01)；与苁蓉益肾颗粒组比较，发酵虫草菌粉高剂量组6 min不动时间缩短，差异有极显著性意义(P<0.01)，发酵虫草菌粉中剂量组6 min不动时间缩短，差异有显著性意义(P<0.05)，发酵虫草菌粉低剂量组6 min不动时间无统计学差异(P>0.05)；与发酵虫草菌粉低剂量组比较，发酵虫草菌粉中剂量组6 min不动时间无统计学差异(P>0.05)，发酵虫草菌粉高剂量组6 min不动时间缩短，差异有极显著性意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠造模前后鼠尾悬挂间断不动时间比较 (只，

2.2 morris水迷宫实验造模前各组大鼠学习成绩无统计学差异(P>0.05)；造模后，与正常组比较，模型组大鼠找到水中平台时间延长，记忆成绩下降，差异有极显著性意义(P<0.01)；与模型组比较，发酵虫草菌粉高、中、低剂量组及苁蓉益肾颗粒组记忆成绩提高，差异有极显著性意义(P<0.01)；与苁蓉益肾颗粒组比较，发酵虫草菌粉高、中剂量组记忆成绩提高，差异有极显著性意义(P<0.01)，发酵虫草菌粉低剂量组记忆成绩提高，差异有显著性意义(P<0.05)；与发酵虫草菌粉低剂量组比较，发酵虫草菌粉高剂量组记忆成绩提高，差异有极显著性意义(P<0.01)，发酵虫草菌粉中剂量组无统计学差异(P>0.05)。见表2。造模前，各组游泳速度无统计学差异(P>0.05)；造模后，与正常组比较，模型组大鼠游泳速度减慢，差异有极显著意义(P<0.01)；与模型组比较，发酵虫草菌粉高、中、低剂量组及苁蓉益肾颗粒组游泳均速度增快，差异有极显著意义(P<0.01)；与苁蓉益肾颗粒组比较，发酵虫草菌粉高、低剂量组速度较快，差异有显著意义(P<0.05)；发酵虫草菌粉高、中、低剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 各组大鼠造模前后学习、记忆成绩比较 (只，

表3 各组大鼠造模前后游泳速度比较 (只，

2.3 血浆ACTH含量与正常组比较，模型组大鼠血清ACTH含量明显升高，差异有极显著性意义(P<0.01)；与模型组比较，发酵虫草菌粉高、中、低剂量组及苁蓉益肾颗粒组ACTH含量降低，差异有极显著性意义(P<0.01)；与苁蓉益肾颗粒组比较，发酵虫草菌粉高、中剂量组含量进一步降低，差异有极显著性意义(P<0.01)，发酵虫草菌粉低剂量组ACTH含量无统计学差异(P>0.05)；与发酵虫草菌粉低剂量组比较，发酵虫草菌粉高剂量组ACTH含量降低明显，差异有极显著性意义(P<0.01)，而与发酵虫草菌粉中剂量组相比无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠造模后血浆ACTH含量比较 (只，

2.4 血清CORT含量造模后，与正常组比较，模型组大鼠血浆CORT含量明显升高，差异有极显著性意义(P<0.01)；与模型组比较，发酵虫草菌粉高、中、低剂量组及苁蓉益肾颗粒组CORT含量降低，差异有极显著性意义(P<0.01)；与苁蓉益肾颗粒组比较，发酵虫草菌粉高剂量组CORT含量降低明显，差异有极显著性意义(P<0.01)，发酵虫草菌粉中剂量组差异有显著性意义(P<0.05)，发酵虫草菌粉低剂量组与其相比CORT含量无统计学差异(P>0.05)；与发酵虫草菌粉低剂量组比较，发酵虫草菌粉高剂量组CORT含量降低明显，差异有极显著性意义(P<0.01)，而与发酵虫草菌粉中剂量组相比无统计学差异(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠造模后血清CORT含量比较 (只，

3 讨论

CFS是一种可发生于成人、青少年、儿童各个年龄阶段的以长期身心疲劳为主要表现的疾病[5]。随着现代人们竞争压力逐渐加大，CFS的发病率呈逐渐升高趋势，国外报道成人患病率在0.23%～2.60%[6]，中学生中患病率在0.1%～2%[7]。目前其病因并不明确，其中很多研究认为长期的精神压力、体力超负荷等多重应激导致下丘脑-垂体-肾上腺素轴异常是其发生的关键原因之一[8]。而我国沈自尹院士认为中医肾虚本质为下丘脑-垂体-肾上腺素轴功能紊乱[9]。《素问·六节藏象论》曰：“肾者，作强之官，伎巧出焉。”《灵枢·海论》中说：“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”。因此肾虚可以导致脑力、体力疲劳的产生。结合以上理论，我们认为中医治疗CFS应以补肾为主。发酵虫草菌粉是从冬虫夏草中分离所得的虫草拟青霉CS-4菌株，经纯化、人工发酵培养加工制成的口服制剂，与天然虫草有着类似的化学成分和药理作用[10]。其可补益肺肾，秘精益气，能够上补肺脏，下补肾脏。明·汪绮石《理虚元鉴》中说：“治虚有三本，肺脾肾是也。”发酵虫草菌粉可用于肺肾两虚导致的精气不足，神疲乏力，不寐健忘，腰膝酸软，月经不调，阳痿早泄等症，不但与CFS症状相符合，也符合治虚治则。

本研究显示：①中药发酵虫草菌粉胶囊能够缩短慢性疲劳大鼠的悬挂不动时间、记忆成绩等疲劳指标，降低慢性疲劳状态下血浆ACTH、CORT水平且随剂量的增大而效果明显。②对抗慢性疲劳状态下ACTH、CORT的增加，抑制HPA轴的功能亢进可能是发酵虫草菌粉治疗CFS有效的机制之一。