参附注射液调控大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的表达机制

苏天生　罗继红　卢静　陈志斌 王志民　廖云海　林磊

【摘要】 目的：研究參附注射液对大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的调控机制。方法：将60只健康SD大鼠随机分为三组，每组20只。模型组和参附注射液组行结扎冠状动脉左前降支（LAD）术建立心肌梗死模型，假手术组冠状动脉不做结扎。模型组和假手术组予以0.9%氯化钠注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，参附注射液组予以参附注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，连续给药12周。比较三组大鼠心肌质量指数。采用Realtime RT-PCR方法检测大鼠心肌microRNA-135a的表达。结果：参附注射液组和模型组大鼠全心质量指数及左心室重量指数均明显高于假手术组，且模型组高于参附注射液组，差异有统计学意义（P<0.01）。与假手术组比较，模型组大鼠心肌microRNA-135a表达量上调，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，参附注射液组大鼠心肌microRNA-135a表达量下调，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：microRNA-135a在心肌梗死中可能发挥重要作用，参附注射液可能通过抑制microRNA-135a的上调，抑制心肌梗死大鼠心室重构，从而改善大鼠心功能。

【关键词】 参附注射液 心肌梗死 microRNA-135a

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.16.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）16-000-03

Mechanism of Shenfu Injection Regulating the Expression of MicroRNA-135a in Rat Model of Myocardial Infarction/SU Tiansheng， LUO Jihong， LU Jing， CHEN Zhibin， WANG Zhimin， LIAO Yunhai， LIN Lei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（16）： -3

[Abstract] Objective： To explore the regulation mechanism of Shenfu Injection on microRNA-135a in rat model of myocardial infarction. Method： A total of 60 healthy SD rats were randomly divided into three groups， with 20 rats in each group. The left anterior descending coronary artery （LAD） was ligated in model group and Shenfu Injection group to establish myocardial infarction model， while the coronary artery in sham operation group was not ligated. Model group and sham operation group were given 0.9% Sodium Chloride Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection， and Shenfu Injection group was given Shenfu Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection for 12 weeks. The myocardial mass index of the three groups was compared. The expression of microRNA-135a in rat myocardial was detected by Realtime RT-PCR. Result： The whole-heart mass index and left ventricular mass index of rats in Shenfu Injection group and model group were significantly higher than those in sham operation group， and the model group was significantly higher than that in Shenfu Injection group， the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with sham operation group， the expression level of microRNA-135a was up-regulated in the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， the expression level of microRNA-135a in rat myocardial was down-regulated in Shenfu Injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： MicroRNA-135a may play an important role in myocardial infarction. Shenfu Injection may improve the cardiac function of rats by inhibiting the up regulation of microRNA-135a and inhibiting the ventricular remodeling of rats with myocardial infarction.

[Key words] Shenfu Injection Myocardial infarction MicroRNA-135a

First-authors address： The Second Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China

急性心肌梗死（AMI）是指由于冠状动脉急性狭窄或闭塞，供血持续减少或终止，所产生的心肌严重缺血坏死。其主要病理生理机制是在冠状动脉粥样硬化的基础上，由于某些机械原因（如高血压或冠状动脉痉挛等）诱发了易损斑块的破裂和血栓形成，产生了急性冠状动脉严重狭窄或完全闭塞的结果。急性心肌梗死在中老年多发，起病急，发病凶险，死亡率高，预后差。急性心肌梗死发展为缺血性心肌病、心衰的核心病理生理机制是心室重构，梗死心肌细胞发生凋亡，导致左心室大小、组织结构发生改变[1]。阻止或逆转心室重构是延缓心力衰竭发生的重要手段。参附注射液有保护心肌、抗休克、改善心功能和微循环等作用，在缺血性心脏病中应用广泛，但其对心肌microRNA-135a影响如何，还未见报道。本试验通过结扎大鼠冠状动脉左前降支（LAD）建立急性心肌梗死模型，研究参附注射液对心肌microRNA-135a的表达机制，为其临床应用提供实验依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 仪器 电子天平、显色剂（Thermo）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、PCR仪（ABI）、PCR管（Axygen）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、垂直电泳仪和转膜系统（美国BIORAD公司）

1.1.2 试剂与药物 逆转录试剂盒（Thermo）、miRNA qPCR Detection Kit（TIANGEN）、microRNA-135a引物（上海英潍捷基贸易有限公司）、75%乙醇、三氯甲烷、10%水合氯醛、参附注射液（SF，规格：10 ml/支，四川雅安三九药业有限公司，批号：Z51020664，每毫升参附注射液含人参皂苷0.5 mg，乌头碱0.1 mg）。

1.1.3 动物 清洁级SD大鼠60只，雌雄不限，体质量220～

290 g，8～12周龄，由福建中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号：（闽检证字）第2013A001号]。随机分为三组：模型组（20只）、参附注射液组（20只）、假手术组（20只）。

1.2 方法

1.2.1 造模 建立大鼠急性心梗模型。通过结扎冠状动脉左前降支造模。通过胸腔内注射10%水合氯醛进行麻醉后仰卧位固定，消毒铺巾，胸骨左缘3、4肋间开胸，充分暴露心脏和冠状动脉，将冠状动脉左前降支分离，模型组和参附注射液组以4号丝线在冠状动脉左前降支近端约2 mm处结扎，然后缝合关胸，假手术组只开胸分离冠脉左前降支，但不予结扎。造模成功后每只大鼠予以腹腔注射5 000 U青霉素以防感染，1次/d。

1.2.2 给药 造模成功7 d后，模型组和假手术组：腹腔注射0.9%氯化钠注射液6.0 ml/（kg·d）。参附注射液组：腹腔注射参附注射液6.0 ml/（kg·d），连续给药12周。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 大鼠心肌质量指数测定 连续给药12周后，处死大鼠取出心脏标本，PSB清洗，滤纸吸干，然后用电子天平称全心质量和左心室质量。全心质量指数=全心质量/体质量，左心室质量指数=左心室质量/体质量。通过心肌质量指数测定可以间接评估心室重构严重程度。

1.3.2 实验大鼠心肌组织microRNA-135a的表达水平 采用Realtime RT-PCR法分析，首先提取心肌组织RNA，取适量心肌组织在液氮中研磨，加三氯甲烷震荡，然后用离心机12 000 r/min离心10 min后弃上清液，以75%乙醇洗涤RNA，再以12 000 r/min

离心10 min后弃上清液加适量DEPC水溶解RNA。RNA溶液稀释后行浓度测定，用紫外分光光度计测定RNA样品在260 nm和280 nm处的OD值，通过OD260/OD280比值鉴定RNA的质量和纯度，选择比值在1.8～2.0的样品，计算其浓度。通过颈环结构的特异性引物反转录相应的microRNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，以双标准曲线方法定量，分析各样本的microRNA-135a浓度。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 22.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠左心室质量指数及全心质量指数比较

参附注射液组和模型组大鼠全心质量指数及左心室重量指数均明显高于假手术组，且模型组高于参附注射液组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.2 三组大鼠心肌microRNA-135a的表达水平比较

与假手术组比较，模型组大鼠心肌microRNA-135a表达量上调，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，参附注射液组大鼠心肌microRNA-135a表达量下调，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

3 讨论

急性心肌梗死在临床上可通过症状体征、心电图、心肌酶谱和肌钙蛋白来诊断。因该病起病急，发病凶险，预后较差，故近年来对急性心梗预防越来越重视，用于诊断该病的检测指标的研究也日新月异，其中microRNAs与心肌梗死诊断的相关性研究较为热门[1-2]。microRNAs是一种非编码的小RNA，在调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程中起重要作用。研究表明，microRNAs在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等心血管疾病中发挥重要的调控作用[3-8]，但microRNAs在急性心肌梗死的作用通过调控哪些靶基因表达及其跨膜信號转导仍未完全明确。有研究表明，microRNA-135a与心脏病关系密切，microRNA-135a参与大鼠心肌细胞凋亡的调控，通过介导各种靶基因调控心肌细胞凋亡通路，影响细胞存活与死亡[9]。

急性心肌梗死属于中医学“真心痛”范畴，真心痛是胸痹进一步发展的严重病证，其特点为剧烈而持久的胸骨后疼痛，伴心悸、水肿、肢冷、喘促、汗出、面色苍白等症状，甚至危及生命。《灵枢·厥论》谓：“真心痛，手足青至节，心痛甚，旦发夕死，夕发旦死。”，其病因病机与年老体衰、阳气不足、七情内伤、气滞血瘀、痰浊化生、寒邪侵袭、血脉凝滞等因素有关。本虚是发病基础。若心气不足，运血无力，心脉瘀阻，心血亏虚，气血运行不利，可见胸痛、心动悸，脉结代（心肌梗死、心律失常），或亡阳厥脱（心源性休克）。本病病位在心，其本在肾。故治疗上可予以温肾回阳救逆、益气固脱。本研究使用的参附注射液是据明代薛己著作《正体类要》中的参附汤制成的中药静脉注射剂，由人参、附子两味中药的提取物混合而成，有回阳救逆益气固脱的功效。

参附注射液对循环系统有显著的作用，有较好的升压、扩张血管、改善微循环、防治全身多器官缺血再灌注损伤的作用。目前参附注射液已广泛应用于临床急危重症抢救，其对心肺复苏后多器官的保护作用越来越受到重视。有研究表明，参附注射液可减轻心肺复苏后大鼠心肌损伤和大鼠机体氧化应激状态，并具有抑制心肌细胞凋亡、改善心功能的作用[10]。参附注射液可改善急性心肌梗死后缺血再灌注患者心脏功能，并能提高患者的后期康复率和生活质量[11-12]。胡丹丹等[13]通过参附注射液对脓毒症大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达影响的研究，表明参附注射液可有效保护大鼠损伤再灌注心肌损伤，抑制心肌细胞凋亡，改善脓毒症实验大鼠心脏功能，故参附注射液保护急性心肌梗死患者心功能，可能与心肌细胞凋亡关系密切，而且有可能通过减少microRNA-135a表达进而抑制心肌细胞凋亡。然而参附注射液在对心肌microRNA的调控方面尚未明确。本研究发现参附注射液组大鼠心肌microRNA-135a表达量较模型组下调，差异有统计学意义（P<0.05）。参附注射液组大鼠全心质量指数及左心室重量指数均明显较模型组低，差异有统计学意义（P<0.01）。故microRNA-135a在心肌梗死中可能发挥重要作用，参附注射液可能通过抑制microRNA-135a的上调，抑制心肌梗死大鼠心室重构，从而改善大鼠心功能。

综上所述，参附注射液抑制microRNA-135a的表达水平是其治疗急性心肌梗死重要分子机制之一。由于心肌梗死心室重构与多种microRNAs有关，本研究该不够深入，参附注射液是否还通过其他microRNAs调控心肌梗死心室重构，还有待进一步的研究。

参考文献

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[13]胡丹丹，徐慧连，楼黎明.参附注射液对脓毒症大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达的影响[J].浙江中西医结合杂志，2016，26（1）：14-17.

（收稿日期：2020-02-13） （本文编辑：桑茹南）