高效液相色谱法测定辅食营养补充品中维生素B1含量

廖雯意 肖之敏 莫益倩 雷艳

摘 要：采用高效液相色谱法检测辅食营养补充品中维生素B1的含量。样品在稀盐酸介质中恒温水解、中和后酶解，水解液用活性人造沸石净化，净化液用碱性铁氰化钾溶液衍生，正丁醇萃取后经C18反相色谱柱分离，用高效液相色谱-荧光检测器检测，外标法定量。通过优化前处理方式调整衍生液浓度以及样品净化的方式，本方法标准曲线相关系数≥0.999，加标回收率在95.2%～99.0%，保留时间稳定且重复性好，RSD值为1.0%，衍生液浓度在40～60 g·mL-1，结果显示本方法适用于检测维生素B1含量较高的辅食营养补充品，减少杂质干扰结果准确度高。

关键词：辅食;营养补充品;维生素B1;高效液相色谱-荧光检测器

Abstract：The content of vitamin B1 in supplementary food supplements was determined by HPLC. The sample was hydrolyzed at constant temperature in dilute hydrochloric acid medium， neutralized and then enzymolysis. The hydrolysate was purified by active artificial zeolite， and the purification solution was derived from basic potassium ferricyanide solution. After extraction with n-butanol， it was separated by C18 reversed-phase chromatographic column， detected by HPLC-fluorescence detector， and quantified by external standard method. The correlation coefficient of standard curve was ≥ 0.999， the recovery rate was 95.2%～99.0%， the RSD value was 1.0%， and the concentration of derivative solution was in the range of 40～60 g·mL-1 Less impurity interference and high accuracy.

Key words：Complementary food; Nutritional supplement; Vitamin B1; High performance liquid chromatography fluorescence detector

中圖分类号：O657.7

辅食营养补充品是一种含多种微量营养素（维生素和矿物质等）的补充品，其中含或不含食品基质和其他辅料，大多数添加在6～36个月龄婴幼儿即食辅食中食用[1-2]，常用的形式有辅食营养素补充食品、辅食营养补充片、辅食营养素撒剂。维生素B1是人体必需的营养物质[3]，易溶于水，在碱性条件下易分解变质，在酸性条件中较为稳定，遇光和热效果下降。辅食营养补充品中维生素B1含量较高，国家标准

GB 5009.84-2016第一法高效液相色谱法对较高含量的样品检测不稳定，基于此，对标准进行优化，从调整衍生剂的浓度和增加样品的净化步骤进行前处理上机。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

（1）材料。强化综合营养素、维生素B1（盐酸硫胺素）≥99.0%、正丁醇（HPLC级）、铁氰化钾（AR）、氢氧化钠（AR）、盐酸（AR）、甲醇（HPLC）、氯化钾（AR）、冰乙酸（AR）、木瓜蛋白酶（酶活力≥800 U·mg-1）、淀粉酶（酶活力≥3 700 U·g-1）、人造沸石（40～60目）。

（2）仪器。高效液相色谱仪-荧光检测器（Agilent 1200型）、高压蒸汽灭菌锅（致微GI80DWS）、万分之一电子天平（梅特勒-托利多，ML204-02型）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

（1）试液提取。准确称取样品约0.5 g于50 mL锥形瓶中，加入30 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液与样品混匀，塞上软塞放入高压灭菌锅120 ℃保持30 min，水解结束待冷却拿出。此时样品水解液pH为2.0～2.5，用10 g·L-1的氢氧化钠溶液调至pH为4.5，加入2 mL混合酶溶液（木瓜蛋白酶1.76 g/50 mL+淀粉酶1.27 g/50 mL），摇匀后置于37 ℃培养箱中放置约16 h，将酶解液转至50 mL比色管中，用水定容至刻度线，摇匀，离心取上清液备用，同时做空白试验[4-6]。

（2）样品净化。用少许脱脂棉铺于层析柱底部，加水将棉中气泡排出加入已活化好的活性人造沸石约8 g（高度不低于45 mm），液面不低于活性人造沸石。准确加入20 mL上述样品提取液，以流速1滴/s通过装好的净化柱，加入10 mL近沸腾的热水冲洗净化柱，弃去淋洗液，如此重复2次。于层析柱下放置25 mL比色管收集洗脱液，加入20 mL温度约为90 ℃的酸性氯化钾洗脱溶液，流速保持1滴/s，待洗脱液冷却至室温后用250 g·L-1酸性氯化钾定容摇匀，即为净化液[4]。

（3）试液衍生。准确移取上述净化液2.0 mL于10 mL试管中，加入2.0 mL碱性铁氰化钾溶液（分别加入20、30、40、60 g·mL-1），涡旋混匀后，准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀约2 min后静置10 min，

约样品出现乳化现象应转至离心管离心处理，待分层后取上层正丁醇萃取层经0.45 μm有机微孔滤膜过滤至棕色进样品中，待上机检测[7]。

1.2.2 标准溶液配制

（1）维生素B1储备液。称取标准样品0.012 78 g，用0.1 mol·L-1盐酸溶液定容至25 mL容量瓶中，摇匀，此时储备液浓度为506 μg·mL-1。置于0～4 ℃冰箱中保存期为3个月。

（2）维生素B1中间液。吸取2.0 mL标准储备液至100 mL容量瓶，用水稀释并定容至刻度线，摇匀，此时溶液浓度为10.12 μg·mL-1。临用前配制。

（3）维生素B1标准系列工作液。分别吸取0、50、100、200、400、800 μL和1 000 μL，用水定容至10 mL容量瓶，标准系列工作液中维生素B1的浓度分别为0、0.051、0.101、0.202、0.405、0.810 μg·mL-1和1.010 μg·mL-1。临用前配制，与样品同时衍生。

1.2.3 仪器条件设定

色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-Aq 4.6×250 mm 5 μm;柱温：30 ℃;流动相：0.38 g/500 mL乙酸铵+甲醇（65+35）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：激发波长375 nm、发射波长435 nm;进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

将标准系列工作液衍生物注入高效液相色谱进行维生素B1的测定，绘制校正曲线，曲线相关系数为0.999 78，如图1所示，标物级别和含量见表1。

2.2 精密度实验

样品通过上述方法进行6次重复性测试，结果见表2，RSD值为1.0%（n=6）。

2.3 样品检测

样品加入不同浓度衍生剂后，随着衍生剂的浓度越高，结果越大，数据结果见表3，样品1组和2组衍生剂浓度低满足不了样品衍生完全，实验样品到第3、4组后衍生剂浓度可以满足样品衍生的终结点，结果数据稳定。样品前处理图谱如图2、图3所示。

2.4 加标回收实验

将已知浓度为10.12 μg·mL-1的维生素B1标准溶液加入4组试验样品中，结果见表4，每组分别加入0.5、2.0、4.0 mL标准溶液。样品1组加标回收率最低，为43.5%～69.6%，样品2组回收率范围偏低，为70.7%～80.6%，3组和4组的回收率达到90%以上，范圍在95.2%～99.0%。

3 结论

维生素B1在检测过程中易受水分、温度、微量元素等各种因素的影响而降解[8]，沸石具有较强的吸附性，样品通过活化后的人工沸石净化后，净化提取液加入衍生检测。实验结果显示通过净化除去杂质干扰以及增加衍生剂浓度的方法第1组以及第2组检测数据因衍生剂浓度较低，样品终结点较高不能完全衍生;第3组和第4组衍生剂浓度40～60 g·mL-1满足样品衍生反应终结点，回收率范围在95.2%～99.0%，结果稳定。此实验方法对含有维生素B1较高的样品检测除去干扰及结果稳定准确，适用于辅食营养补充品中维生素B1的含量测定。

参考文献：

[1]傅红雪，陈万勤，刘 柱，等.3种前处理-HPLC法测定婴幼儿配方食品中维生素B1[J].食品工业，2020（4）：281-285.

[2]邱清莲，秦 菁，黄成安，等.含葡萄籽提取物的保健中品维生素B1含量的测定[J].食品安全质量检测学报，2018（23）：6267-6271.

[3]范 玲，蔺丹华，侯 赛，等.花生维生素检测方法的研究进展[J].现代食品，2020（7）：15-16.

[4]国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.84-2016食品中维生素B1的测定[S].北京：中国标准出版社，2017.

[5]张隆龙，王海燕，胡 越，等.高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中的维生素B1、B2[J].食品安全质量检测学报，2019（1）：129-134.

[6]倪炜华，陈 妍，边国军.婴幼儿配方奶粉中维生素B1的检测及其衍生物稳定性的研究[J].中国乳品工业，2018（12）：43-45.

[7]陶大利，李 琴，白 鹤.乳制品中维生素B1检测条件优化研究[J].现代食品，2018（20）：120-124.

[8]李 兰，贾 静，肖志明，等.利用沸石吸氨氮机理解决预混合饲料中维生素B1的准确度研究[J].中国饲料，2020（1）：64-67.

作者简介：廖雯意（1992—），女，本科，助理工程师;研究方向为食品及相关产品的检测。