Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的构建及其IDO1活性和表达的研究

郭磊磊　杨青

【摘 要】目的：建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型，并研究该模型中吲哚胺2，3-双加氧酶1 （indoleamine 2，3-dioxygenase 1， IDO1）的活性和表达，为研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制剂的药效奠定基础。方法：培养收集Hepa1-6小鼠肝癌细胞并调整浓度至2×106/50 μL，将其注射于小鼠肝左叶中，术后14天处死小鼠，收集血清，解剖并观察小鼠肝脏肿瘤的形成情况，对肿瘤组织进行HE染色，qPCR法和Western blot法分别检测肿瘤中IDO1 mRNA和蛋白的表达水平，HPLC法检测血清中色氨酸和犬尿氨酸的含量。结果：小鼠肝上形成肿瘤且呈弥漫性生长并发生肝叶间的转移;肝癌小鼠血清中IDO1活性、肿瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平的表达比野生型小鼠的均高。结论：成功建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型，该模型可用于IDO1功能及IDO1抑制剂药效学研究。

【关键词】原位肝癌;吲哚胺2，3-双加氧酶1（IDO1）;IDO1抑制剂

【中图分类号】R730.3【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2020）06-18--01

肝癌是世界范围内的恶性肿瘤，预后差，现有的治疗效果不尽人意。免疫疗法是肝癌治疗的新希望，免疫检查点阻断疗法在肝癌中已有应用[1]。吲哚胺2，3双加氧酶1（indoleamine-2，3-dioxygenase 1，IDO1）是犬尿氨酸代谢通路中的关键限速酶，催化人体必需氨基酸色氨酸（tryptophan，Trp）分解代谢生成L-犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）。它在多种肿瘤里高表达，使肿瘤组织中CD8+ T细胞功能和增殖減弱，Foxp3+ Treg细胞增殖，促进肿瘤细胞生存及肿瘤免疫逃逸等[2]。IDO1被认为是潜在的免疫检查点，IDO1抑制剂是肿瘤免疫治疗的新型候选药物[3]。目前尚无IDO1抑制剂药物上市，但多个IDO1抑制剂如Indoximod、Epacadostat、BMS986205等已经进入临床试验，其中包括BMS986205与PD-1抗体联合治疗肝癌的一项I期/II期临床实验（NCT03695250）[4]。

本研究在建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的基础上，研究了该模型血清中IDO1活性和肝肿瘤中IDO1 mRNA与蛋白水平的表达，为研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制剂的药效学奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1 主要实验材料

C57BL/6小鼠（上海杰思捷实验动物有限公司）、Hepa1-6小鼠肝癌细胞（）、HE染色试剂盒（华安生物）、逆转录及qPCR试剂盒（诺唯赞）、IDO1抗体（华安生物）等。

1.2 试验方法

培养收集Hepa1-6细胞并用PBS调整浓度至2×106/50 μL。脱毛膏褪去小鼠胸腔和腹部的毛并腹腔注射160 μL 5%水合氯醛使小鼠麻醉;沿小鼠剑突剪开1cm的开口，使肝左叶暴露并注入50 μL细胞悬液（含2×106个细胞），棉球按压止血30 s，器官归位并缝合创口。术后1-3 h小鼠苏醒，正常饲养。术后14天，小鼠引颈处死，收集血清，解剖并观察肝肿瘤发生和发展情况，收集小鼠肝肿瘤组织。HPLC检测血清中Kyn和Trp含量，肿瘤组织进行HE染色，提取肿瘤组织总RNA和蛋白，用qPCR法和Western blot法检测IDO1 mRNA和蛋白表达。具体实验步骤参照文献[18]。

1.3 统计学分析

采用Grapsd Prism 5.0进行数据处理和图像绘制，所有实验数据均以平均数±标准误（±se）表示，两组数据间比较采用独立样本t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模情况

术后14天小鼠腹部伤口全部愈合，手术缝合线全部自动脱落。人道主义处死小鼠，解剖并取出肝脏组织，进行观察，如图1所示，棕色部分为肝组织，白色部分为肿瘤组织，肿瘤在肝上大面积弥散性生长，并且已经发生肝叶间的肿瘤转移，小鼠接瘤14天后存活率和成瘤率均为100%。

2.2 组织病理检查

肝肿瘤组织HE染色结果如图2所示，深紫色部分为肿瘤区（黄色圈区域），其细胞排列无规则，细胞核大，染色较深;浅紫色偏红区域为正常肝区，细胞排列整齐，细胞核染色较浅。此外有小片独立的肿瘤区出现（黑色箭头指处），表明肝癌细胞已在肝内发生转移，印证了上述解剖观察结果。

2.3 肝肿瘤组织中IDO1 mRNA和蛋白表达水平的检测

qPCR法检测肝肿瘤组织中IDO1 mRNA的表达，Western blot法检测IDO1蛋白的表达，以野生型（WT）小鼠正常肝组织为对照，结果如图3所示Hepa1-6原位肝癌小鼠肝肿瘤组织中表达的IDO1 mRNA和蛋白均比WT小鼠的高。

2.4 小鼠血清中IDO1活性的检测

HPLC法检测野生型小鼠（WT）和Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中Trp和Kyn的浓度，以（Trp/Kyn）*100的比值来定量表示小鼠血清中的IDO1活性。结果如图4所示，Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中Kyn浓度水平较WT小鼠的高，Trp浓度水平与WT的基本一致，（Kyn/Trp）*100的值变化与Kyn浓度水平变化一致，即Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中的IDO1活性高于WT小鼠血清中的。

3 讨论

Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中IDO1活性是野生型小鼠的2.5倍，本底IDO1活性较高，能较好的反映在给予IDO1抑制剂后小鼠血清中IDO1活性的变化情况。同时，Hepa1-6原位肝癌小鼠血清中IDO1活性和肿瘤中IDO1的表达均高，是研究IDO1与肝癌关系的良好工具。

总之，本研究在建立Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的同时，研究了该模型血清中IDO1活性和肝肿瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平IDO1的表达，发现肝癌小鼠血清中IDO1活性、肝肿瘤中IDO1 mRNA和蛋白水平的表达均较野生型小鼠中的高，为研究IDO1在肝癌中的作用及IDO1抑制剂的药效学奠定基础。

参考文献】

周晨，刘家成，石钦，等. 肝癌分子靶向药物及免疫抑制剂治疗的研究现状及进展[J]. 中华介入放射学电子杂志，2019，7（3）：243-250.

毛耀南，于萍，任敬慧，等. IDO小分子抑制剂的研究进展[J].实用药物与临床，2020，23（2）：186-192.

https：//clinicaltrials.gov/

李天祺，赛音贺西格和杨青. 可用于IDO1抑制剂药效学研究的KPIC原位胰腺癌小鼠模型的构建[J]. 复旦大学学报（医学版），2019，46（5）：576-583.