生鸡屠宰场屠宰环节单核细胞增生李斯特菌的分子分型研究

孙晓文，陈思思，王小丁，姚 浩，田禹齐，焦新安，殷月兰

（扬州大学 江苏省人兽共患病重点实验室/江苏省动物重要疫病和人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一种重要的人兽共患食源性病原菌，通过肉制品、乳制品等动物源性食品传播，感染该致病菌后能引起发热性胃肠炎、败血症、脑膜炎、孕妇流产等症状，致死率高达20%～30%[1]。美国、加拿大、法国等国家多次报道了李斯特菌病的暴发流行，它已严重威胁全球公众健康，引起了各国政府管理部门的高度关注[2]。2000 年，WHO 将Lm 列为4大食源性病原菌之一，2000 年，我国建立了包括Lm在内的全国食源性致病菌监测网，加大了对该致病菌的监测力度。2014 年我国颁布的《食品中致病菌限量》中提出对即食肉制品中Lm 的零容忍政策。

鸡肉是我国人民日常生活中重要的动物产品，鸡肉的生产加工和销售过程中时常存在Lm 污染，给人类的健康造成了潜在的威胁。有关研究报道指出市售鸡肉产品中Lm 的污染情况较为严重，据世界卫生组织（WHO）的统计，15%以上的禽产品受到Lm 污染[3]。因此了解生鸡屠宰过程中Lm 的污染状况，有利于加强对屠宰环节的卫生监督和管理，以预防Lm 引起的食源性疾病的发生。为探究生鸡屠宰过程中Lm 的污染状况，本研究对江苏淮安某生鸡屠宰场的4 个屠宰环节（烫煺、净膛、预冷清洗、分割传送）进行样品的采集，对Lm 分离株进行血清学、多位点序列分型（MLST）分析，明确Lm 在生鸡屠宰链的传播特征，为企业制定相关措施控制Lm 污染提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品来源2018 年8 月～2018 年11 月，选择江苏淮安某生鸡屠宰场定点采集样品，从整个屠宰流水线选择烫煺、净膛、预冷清洗、分割传送4 个环节采集肉鸡胴体擦拭样品，共采集肉鸡胴体擦拭样160 份，另外采集屠宰过程中使用的工具以及地面等环境擦拭样品40 份。

1.2 培养基与试剂UVM 改良李斯特菌增菌培养基、Fraser 基础培养基、脑心浸出液（BHI）培养基、缓冲蛋白胨水购自BD 公司；李斯特菌显色培养基购自法国科马嘉公司；MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit、DL2000 DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；Lm诊断血清购自日本生研公司。

1.3 Lm 的分离培养根据美国食品药品监督管理局李斯特菌的检验方法分离Lm[4]。在棉球擦拭样品中倒入适量的UVM 增菌液，30 ℃培养20 h～26 h。取100 μL 菌液加入10 mL Fraser 增菌液中，37 ℃培养26±2 h。取50 μL 菌液于李斯特菌显色培养基上划线，37 ℃培养18 h～24 h。挑取蓝绿色且带白色晕环的单菌落在BHI 固体平板上纯化培养，用于后期进一步的鉴定。

1.4 分离菌株的PCR 鉴定以煮沸法提取的分离菌DNA 为模板，利用文献[5]中Ino2、MonoA、Siwi2和LisB 4 种引物对分离菌进行PCR 鉴定。

1.5 Lm 的血清型鉴定挑取BHI 固体平板上的单菌落接种于5 mL BHI 液体培养基中过夜培养，利用基因组提取试剂盒提取分离菌株的基因组，以其为模板，利用文献[6]中Lmo0737、ORF2110、ORF2819、Lmo1118 和prs 5 种基因的引物进行PCR 鉴定，初步确定分离菌株的血清型，进一步利用Lm 诊断血清采用玻片凝集法鉴定分离菌株的血清型，方法和结果判定标准参考产品说明书。

1.6 分离菌株的MLST 型按照法国巴斯德Lm 多位点序列分型数据库（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria. html）提 供 的7 对 管 家 基 因（abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA）进行MLST 分型的PCR扩增，PCR 产物采用双向测序，利用BioEdit 软件将测序得到的基因序列拼接后，提交至Lm 的MLST 数据库（https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/），从而获得相应的ST 型，最后利用BioNumerics 软件绘制不同血清型和屠宰环节的最小生成树（Minim Spainning Tree）。

2 结果与讨论

2.1 Lm 的分离鉴定结果从江苏淮安某生鸡屠宰场屠宰环节采集的200 份样品的检测结果显示，有40 份样品分离出Lm，总分离率为20.0%，其中环境擦拭样品（工具以及地面等擦拭样品）Lm 分离率为37.5%（15/40），肉 鸡 胴 体 擦 拭 样 品Lm 分 离 率 为15.6%（25/160）。1995 年～1996 年，在瑞典肉鸡屠宰场采集肉鸡擦拭样品，结果显示有50%样本检测出Lm[7]。1998 年11 月～1999 年4 月，王 振 国 等 人 在 长春某肉鸡屠宰加工厂采集152 份冻鸡肉样品，其中Lm 的检出率为10.5%[8]。以上Lm 的流行病学调查主要针对屠宰场的鸡肉，但对于Lm 在屠宰各个环节的污染以及传播规律少有报道。因此，本研究对Lm在整个屠宰链中的传播规律进行了调查研究。

本研究中烫煺环节、净膛环节未分离出Lm；分割传送环节分离出10 株Lm，分离率为25.0%；预冷清洗环节分离出15 株Lm，分离率为37.5%；地面、刀具等环境擦拭样品中分离出15 株Lm，分离率为37.5%（图1）。调查结果表明，Lm 污染主要存在于屠宰加工线后期。屠宰流程前期的烫煺、净膛环节不存在Lm 污染，而在预冷清洗环节Lm 污染率最高，之后的分割传送环节的污染率较预冷清洗环节略有下降。本研究中Lm 的污染规律与国外的报道基本一致：1995 年～1996 年瑞典对一家肉鸡屠宰场的调查显示，Lm 污染主要存在于屠宰加工线后期[7]。另外，本研究屠宰场的环境也存在Lm 的污染（37.5%），在屠宰场工人使用的刀具和地面等环境中均分离到Lm，提示该屠宰场屠宰操作技术及屠宰工艺有待改善。

图1 屠宰场各环节Lm 的分离率统计结果Fig.1 Positive rate of Lm from different links in slaughterhouse

2.2 Lm 的血清型分型结果采用多重PCR 和O 抗原玻片凝集结合的方法检测分离菌株的血清型。结果显示，40 株Lm 分为3 种血清型，包括19 株血清型为1/2c（47.5%）、12 株血清型为1/2a（30.0%）、9株血清型为1/2b（22.5%）。结果表明，血清型1/2c 为分离Lm 的优势血清型。

2.3 Lm 的MLST 分型结果MLST 分型结果显示，40 株Lm 共分为8 种ST 型，其中优势ST 型为ST9 型（16/40，40.0%），其余依次为ST87（8/40，20.0%）、ST8（4/40，10.0%）、ST101（3/40）、ST378（3/40）、ST307（2/40）、ST330(1/40)。此外，还发现了一种新的ST 型（图2），它与ST9 仅有一个等位基因的差异，在7 个管家基因中，拥有6 个及以上相同等位基因的菌株属于同一个克隆复合群（Clonal complexes，CC），结果表明新的ST 型与ST9 同属于CC9，而CC9 在国内食品中普遍存在，其具有引起人类李斯特菌病散发的潜在风险。以颜色标记菌株的血清型，ST9、ST101 对应1/2a 和1/2c 两种血清型，其它每一种ST 型均仅对应一种血清型（图2），结果表明，菌株的血清型与ST 型具有高度对应性。

图2 不同血清型Lm 的ST 型最小生成树Fig.2 Minimum spanning tree of Lm isolated from different serotypes

对屠宰过程中不同屠宰环节的分离菌株进行MLST 分型比较结果显示，不同屠宰环节的分离菌株具有相同的ST 型，ST87、ST9 型菌株均能在预冷清洗、分割传送环节分离到（图3）。这些结果提示，Lm 在屠宰场中可能是沿着屠宰链传播。从进化树的分析来看，肉鸡胴体擦拭样和环境样品中分离到的Lm 分离株之间存在相同的ST 型（ST9、ST87、ST8、ST101、ST307、ST378），具有比较近的遗传进化关系，表明屠宰环境和肉鸡胴体之间可能存在交叉污染。

图3 不同屠宰环节中Lm 的ST 型最小生成树Fig.3 Minimum spanning tree of Lm isolated from different slaughtering links

本研究对Lm 的MLST 分型结果显示，其优势ST 型为ST9，其次为ST87 和ST8。Chen 等对2012年～2016 年中国43 个城市1 212 份样品中分离到的362 株食源性Lm 的MLST 分析结果显示，ST9 为最常见的ST 型，其次为ST8、ST87[9]。这与本研究结果一致，表明市售鸡肉产品中的Lm 污染可能来源于上游屠宰环节。值得注意的是，ST87 是引起我国人李斯特菌病的优势ST 型，2007 年～2012 年在中国4 个省市引起的28 例临床李斯特菌病的Lm 中，最常见的ST 型为ST87（9/28）[10]。其次，ST8 是常见的引起人类李斯特菌病Lm 的ST 型，2004 年～2012年，丹麦大多数李斯特菌病散发病例与ST8 相关[11]。基于ST87、ST8 是该屠宰场的优势ST 型，食用该屠宰场生产的鸡肉产品可能引起人类李斯特菌病，因此需要加强对该屠宰场的监测和卫生管理，以降低Lm 在屠宰环节的污染，为鸡肉进入餐桌环节严把质量关，以预防和减少食源性李斯特菌病的发生。