西藏那曲市牦牛源莫拉杆菌的分离鉴定与敏感药物筛选

马弘财，元振杰，张丽鸿，李脂幸，吴庆侠，储岳峰，罗建勋，李家奎，曾江勇*

（1. 西藏自治区农牧科学院 畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2. 华中农业大学 动物医学院，湖北 武汉 430070；3. 西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；4. 中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046）

莫拉杆菌（Moraxella bovis）是牛传染性角膜结膜炎（红眼病Pink eye）的主要病原[1]，根据相关研究，莫拉杆菌引起的传染性角膜结膜炎呈逐年上升趋势[2-4]。在美国[4-6]、日本[2-4]、巴基斯坦[7]等国家将莫拉杆菌定为眼部疾病的病原菌。牛莫拉杆菌（Moraxella bovis）又称牛嗜血杆菌，该病原菌可通过接触传染给健康牛，但主要还是通过蝇类及一些飞蛾机械性传播[1,8]。该菌革兰氏染色呈阴性，对培养基的要求较高，在鲜血平板培养基生长较好，有些菌种可以在麦康凯培养基上生长，莫拉杆菌不分解任何糖类，吲哚试验为阴性[9]。

莫拉杆菌虽然感染的部位是眼睛，但该病在美国最常见的牛病中居于第二位[9]，常引起较大的经济损失。该菌致病率较低，对人和动物通常没有较大的危害[3]，所以研究该菌的报道也相对较少，莫拉杆菌感染引起的牛传染性角膜结膜炎需要在强烈的太阳紫外光照射下才能产生典型的临床症状[1]，西藏那曲平均海拔4 500 m 及以上，有着强烈的太阳紫外光，为该菌感染牦牛并表现出致病症状提供了天然条件，致使西藏牦牛普遍感染该病，严重者导致牦牛失明，如治疗不及时还可能导致死亡，所以在西藏研究该病原菌具有重要意义。

实地调查显示该病主要集中感染24 月龄以下的牦牛犊牛，每年9 月～11 月发病最为严重。西藏那曲2017 年11 月首次发现该病，病初临床表现为体温升高、眼睛红肿、持续性流泪、后期为眼角黄色脓液，失明等症状，发病率高达90%以上。

为了掌握莫拉杆菌对牦牛的感染情况及采取有效的防治措施，2019年本研究室在西藏那曲发病区无菌采集具有体温升高、眼睛红肿、持续性流泪、眼角黄色脓液、失明等临床症状牦牛的28 份鼻拭子及30 份眼拭子，开展了牦牛源莫拉杆菌的分离鉴定与敏感药物筛选，为今后更好的治疗和防控该病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 临床样品与主要试剂28 份眼拭子和与其对应牛的28 份鼻拭子，以及另外2 头牦牛的眼拭子，均采自西藏那曲发病区发病牦牛。

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、全套生化鉴定管、药敏纸片均购自青岛海博生物科技有限公司；脱纤绵羊血购自上海索莱宝科技有限公司；rTaq DNA 聚合酶、PCR 试剂和DL2000 DNA Marker 均购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 细菌分离培养将无菌采集的鼻拭子和眼拭子样品置于含血清的灭菌TSB 肉汤中，37 ℃恒温培养18 h 后用接种环划线于脱纤维绵羊鲜血培养基，37 ℃需氧培养24 h；挑取带有宽溶血环的单个菌落划线接种于脱纤维绵羊鲜血培养基，37 ℃需氧培养24 h，进行细菌的纯化。连续4 代纯化培养后经革兰氏染色镜检。

1.3 分离菌株的生化试验按照生化试剂说明书，将纯化的单菌落分别接种于赖氨酸脱羧酶、氨基酸脱羧酶、枸橼酸盐、H2S、尿素、蛋白胨、苯丙氨酸、甘露醇，葡糖糖，吲哚、MR-VP 和山梨醇的生化培养管中，37 ℃需氧培养24 h，观察其生化反应特性，分析试验结果。

1.4 16S rRNA 基因的PCR 扩增及序列分析挑取单菌落，按照常规方法，利用16S rRNA 通用引物进行菌液PCR 扩增，引物序列为F27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/R1492：5'-TACGGCTACCTT GT TACGACTT-3'，引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，扩增长度约为1 487 bp。PCR 产物经回收纯化后由武汉擎科生物技术有限公司测序。

将测序结果与GenBank 数据库中登录的莫拉杆菌进行同源性比对分析，并利用DNAStar 软件构建该细菌16S rRNA 基因的遗传进化树。

1.5 药敏试验采用常规纸片法[10]，检测本研究分离菌株对复方新诺明、万古霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、红霉素、多西环素、新霉素、青霉素、苯唑西林、丁胺卡那、头孢呋辛、头孢他啶头孢唑啉、庆大霉素、克林霉素、氯霉素、卡那霉素的药物敏感性。

2 结果与讨论

2.1 细菌的分离培养结果无菌采集牦牛的鼻拭子和眼拭子接种于脱纤维绵羊血培养基，经连续4 代纯化培养后可见2 株无色光滑、半透明的小菌落，并带有溶血环，呈β溶血。符合莫拉杆菌菌落形态特征。

纯化细菌经革兰氏染色，镜检，呈阴性，菌体接近球状的短小杆菌，综合菌落形态和革兰染色特征，结合发病牦牛临床症状分析，初步判定分离菌株为莫拉杆菌。造成此次莫拉杆菌分离率较低（仅2株）的原因可能有以下几点：首先本试验样品是在采样后2 个月进行该细菌的分离，保存时间较长；其次，可能是培养条件不同造成的：莫拉杆菌的培养条件是34 ℃，需氧培养24 h～48 h[8]，而本实验是按细菌的常规培养方式37 ℃，培养18 h～24 h。

本实验是从牦牛鼻拭子中分离出来的莫拉杆菌，而非病变部位的样品—眼拭子分离得到，这是由于鼻腔与眼睛通过鼻泪管连通，该细菌可能在两个器官之间发生了转移；还有本研究在采样的时候发现，大部分病牛眼部的脓液都已结痂，在用棉签蘸取病料时可能只蘸取了眼睛正常分泌物，而不是病变的脓液；再者该细菌是否会在不同时期感染不同的器官有待进一步研究。

2.2 生化试验结果生化鉴定结果显示，分离菌对甘露醇和山梨醇的生化试验呈阳性，其他生化试验结果呈阴性。所分离得到的2 株菌均符合莫拉杆菌的生化反应特性。

2.3 分离菌株16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析结果以分离菌株的DNA 为模板，采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR 鉴定。结果显示：在约2 000 bp处可见目的条带，大小与预期相符（图1）。测序分析结果显示目的基因与GenBank 登录的莫拉杆菌同源性为97%～100%。16S rRNA基因遗传进化树结果显示，分离菌 与 莫 拉 杆 菌（DQ153089.1 和NR_043583.2）聚 为 一支（图2）。进一步表明本实验分离的菌株为莫拉杆菌。本实验分离菌株16S rRNA 基因的PCR 扩增序列与GenBank 登录的所有莫拉杆菌16S rRNA 基因序列的同源性达到97%以上，与莫拉杆菌（DQ153089.1和NR_043583.2）序列同源性达到100%。同样表明本研究分离的菌株为莫拉杆菌。

图1 分离菌株16S rRNA 基因PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification result of 16S rRNA gene of the isolates

图2 莫拉杆菌分离株16S rRNA 基因的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequence of the Moraxella isolates

2.4 药敏试验结果分离菌株的药敏试验结果显示：该菌对环丙沙星、氧氟沙星、红霉素、新霉素、丁胺卡那及诺氟沙星6 种抗生素高度敏感，而对临床上常使用的青霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明和多西环素5 种抗生素耐药，对头孢类及其它药物呈中介耐药（表1）。

表1 分离菌株药敏试验结果Table 1 Result of the antibiotic sensitivity test of the isolates

据相关研究[11-13]报道，由于莫拉杆菌血清型众多，疫苗的使用对该细菌引起的传染性角膜结膜炎的预防没有实质性的作用。目前，对该细菌最有效的治疗方法仍然是抗生素治疗[14]，而本实验通过药敏试验，初步筛选了对牦牛莫拉杆菌敏感的环丙沙星等6 种药物，其中莫拉杆菌对红霉素敏感的结果与巴西羊源莫拉杆菌耐药结果一致[14]。

由于受传统宗教文化的影响，以及牦牛价格较高，本研究未做动物回归试验，后续将通过小白鼠进一步研究莫拉杆菌的毒力及感染情况。

本研究通过对分离鉴定的2 株西藏那曲市牦牛源莫拉杆菌的药敏试验，筛选出一批适合当地牦牛源莫拉杆菌治疗的药物，为那曲及其它牧区、半农半牧区治疗和防控牦牛传染性角膜结膜炎的用药提供了参考依据。