澳洲墨瑞鳕源寄鱼不动杆菌的致病性及药敏特性研究

罗土炎，刘 洋，张志灯，饶秋华，罗 钦，何肖云

（1. 福建省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003；2. 福州海关技术中心，福建 福州 350003）

不动杆菌属（Acinetobacter）菌株广泛分布于自然界中，主要栖息在水体和土壤中，易生存于潮湿环境中，目前有效发布的属于不动杆菌属有63 个种，且在不断增加，其中包括鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）[1]、鲁氏不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）[2-3]、溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolytius）、约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新发现的类鲁氏不动杆菌（Acinetobacter pseudolwoffii）等。研究发现不动杆菌属内菌株多为条件致病菌，其中鲍曼不动杆菌引起医院内感染频发，耐药菌株不断增多，因此该属细菌被广泛关注[4]。

澳洲墨瑞鳕（Murray cod，Maccullochella peelii peelii），又称河鳕、东洋鳕、鳕鲈、澳洲淡水鳕鲈等，中国大陆称为澳洲龙纹斑、虫纹鳕鲈或虫纹石斑，是原产于澳大利亚墨瑞河流域的一种著名淡水经济鱼类[5-6]，其肉质口感鲜美，营养丰富，目前已成为我国重要的新兴的水产养殖经济鱼类之一，其推动了淡水养殖品种的结构调整。2017 年4 月浙江省乐清市某设施养殖场内，澳洲墨瑞鳕出现腹部肿大，烂尾，部分养殖池出现大量死亡，死亡率达56%。解剖发现鱼腹中有淡红色腹水，肝脏、肾脏等实质性器官出现充血、肿大，后肠充血糜烂，肌肉有针尖状出血点。本课题组通过培养特性，全基因测序，在此次患病澳洲墨瑞鳕病灶首次获得了一株寄鱼不动杆菌（Acinetobacter piscicola）LW15[7]，为进一步确定该菌株是否为患病鱼致病菌等，本实验对其进行基因进化分析，致病力及药物敏感性等检测，旨在为澳洲墨瑞鳕由该菌引起的疾病有效防治提供理论依据，并为该病防治积累资料。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料寄鱼不动杆菌（Acinetobacter piscicola）LW15 为本实验室前期分离保存[7]；脑心浸液培养基（BHI）购自BD 中国代理机构；细菌基因组DNA 提取试剂盒、TaqDNA 聚合酶购自生工生物工程（上海）股份有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；试验中所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 16S rDNA 基因扩增和系统发育树构建将纯化后的菌株LW15 接种到BHI 液体培养基中，28 ℃摇床培养16 h，11 000 r/min 离心收集菌体，利用DNA 提取试剂盒提取细菌总DNA 作为模板，采用通用 引 物：27F：5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCA G-3'/1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'PCR 扩增细菌16S rDNA，扩增产物由福州博尚生物技术有限公司测序，测序结果提交到ezbiocloud（https://www.ezbiocloud.net/）进行比对鉴定。

1.3 动物回归试验及致病性检测按照麦氏比浊法将1.2 中菌液分别配置成浓度为1×109cfu/mL（A组），1×108cfu/mL（B 组）、1×107cfu/mL（C 组）、1×106cfu/mL（D 组）、1×105cfu/mL（E 组）的菌液。将健康澳洲墨瑞鳕在实验室暂养10 d 后随机分成6 组，每组30 尾，采用腹鳍基部注射法，分别注射0.5 mL不同浓度梯度的菌液，对照组注射0.5 mL 灭菌PBS（F 组），每组设置3 个平行组。连续观察7 d，记录死亡情况，计算7 d 总平均死亡率。通过IBM SPSS statistics 22.0 软件计算菌株LW15 对健康澳洲墨瑞鳕的半数致死浓度（LD50）。同时取回归感染濒死澳洲墨瑞鳕溃疡组织和内脏组织进行细菌的再分离培养与鉴定，以确定致病菌。

1.4 毒力基因分析将菌株LW15 全基因组序列（NIFO00000000）[7]提交到毒力因子数据库（VFDB，Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）进行注释，获取基因组中毒力基因信息并进行分析。

1.5 抗生素敏感试验采用纸片扩散法（K-B 法）进行药敏试验，每种药物设三个重复。28 ℃培养24 h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取抑菌圈直径平均值，根据美国临床实验室标准研究所出版的药敏试验指南[8]的标准判定菌株对不同药物的敏感性。质控菌株为大肠杆菌（ATCC25922）。

2 结果与讨论

2.1 16S rDNA 序列分析将扩增的菌株LW15 的16S rDNA 序列（1 501 bp）（图略）提交GenBank 数据库，登录号为MF062566。并对该序列进行同源性比对分析，结果显示其隶属不动杆菌属（Acinetobacter），16S rDNA 与Acinetobacter guillouiae CIP 63.46T同源性最高，为97.7%，与其聚集到一个进化分支，但与其它菌株形成相对独立的进化位置（图1）。进一步表明该菌为寄鱼不动杆菌。

图1 基于16S rDNA 的系统发育树（邻近法）Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of LW15 isolate and relative stains.Bar,0.005 Knuc

最近，国内学者从草鱼、异育银鲫、锦鲤等鱼类体内分离到致病性厦门不动杆菌、鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌等[9-11]；而张涵等研究表明三角帆蚌、银鲫、青鱼、鳙等肠道优势菌群均有不动杆菌属，推测不动杆菌为淡水鱼类肠道优势菌[12]。本实验分离的寄鱼不动杆菌为国内首次从澳洲墨瑞鳕患病鱼体内分离获得。

2.2 回归感染及致病性试验结果试验组澳洲墨瑞鳕在腹鳍基部接种感染初期，表现为游动缓慢，离群独游或静止不动，食欲废绝，腹部贴于池底；解剖患病或濒死病鱼肝脏、肾脏出现充血、肿大，肠壁充血。与自然发病澳洲墨瑞鳕临床症状和病变相似。同时，从感染濒死鱼体的肝脏内再次分离到寄鱼不动杆菌，其形态、生理生化特征与菌株LW15 一致，表明菌株LW15是此次澳洲墨瑞鳕患病的病原菌。

利用不同浓度梯度的细菌对健康的澳洲墨瑞鳕进行回归感染后连续观察7 d，发现健康澳洲墨瑞鳕在回归感染2 d 后，A 组全部死亡，总平均死亡率为100%，4 d 以后B 组、C 组、D 组不再出现死亡，总平均死亡率分别为85.6%、68.9%、34.4%，E 组与对照组未见死亡。经计算，菌株LW15 对澳洲墨瑞鳕半致死浓度为4.26×106cfu/mL。

澳洲墨瑞鳕作为新兴产业刚刚起步，关于不动杆菌对其致病性的报道尚较少，本研究通过对本课题组前期分离的寄鱼不动杆菌LW15进一步的研究，首次证实该菌株对澳洲墨瑞鳕具有一定的致病性。

2.3 毒力基因检测结果菌株LW15 的基因大小为3.57×106bp, 通过注释共得到3243 个编码蛋白的基因，G+C 含量为37.2 mol%。通过毒力基因数据库注释发现菌株LW15 携带224 个毒力基因（图2），其中invasion，adherence 和toxin 等3 类别毒力基因中分别包含2，43 和3 种基因。

图2 菌株LW15毒力基因预测分类表Fig.2 Prediction classification table of LW15 isolate virulence genes

Invasion毒力因子包含编码鞭毛生物合成sigma因子和一个调节蛋白，其中鞭毛自身及其运动性可促进细菌对于宿主细胞的黏附与侵袭，在细菌生物被膜形成过程中起重要作用，与细菌毒力因子的分泌也密切相关，并且鞭毛素蛋白能通过与细胞上Toll 样受体5（TLR5）结合而诱导机体促炎性反应等[13]。Adherence中包含28 个合成IV 型菌毛的基因，IV 型具有独特的结构，动力学及生物物理学特征，该类菌毛与菌株的致病性相关[14]，还包含革兰氏阴性细菌毒素脂多糖及吸附蛋白等。Toxin 毒力因子包含3 条编码环化腺苷酸合成酶（Adenylate cyclase，AC）的cya 基因，该基因在沙门菌中充当毒力调节基因[15]，cya 基因缺失突变株可制作弱毒疫苗，该基因在不动杆菌的功能迄今尚未见报告。此外，在菌株LW15 基因组中预测到ompA 基因，该基因表达外膜蛋白A，参与鲍氏不动杆菌的生物膜形成，在多种致病机制中扮演着重要角色[16]。

生物信息学分析表明菌株LW15 具有相关毒力因子，进一步证明其可能是造成此次浙江省乐清市某养殖厂澳洲墨瑞鳕大量死亡的主要致病菌。

2.4 分离菌的药敏试验结果质控菌株ATCC25922的抑菌圈大小在允许范围内，药敏结果显示，菌株LW15 对氧氟沙星、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、头孢曲松、丁胺卡那、哌拉西林等21 种药物敏感；对羧苄西林和呋喃唑酮2 种药物中度敏感；对四环素、克林霉素、头孢拉定、头孢氨苄、苯唑西林等7 种药物不敏感（表1），表现出对多种药物的耐药。造成该现象的原因包括两方面，一方面可能是在养殖过程中长期或大量使用该类药物所造成的耐药；另一方面是该菌株对这些药物本身就不敏感[17]；同时，产生药敏特性差异也可能是由于不同区域、不同养殖环境中的菌株受不同药物环境作用影响而产生耐药性变异[18]。耐药性不动杆菌对养殖鱼类的感染不仅危害养殖业本身，同时，也可能导致人类的食源性感染，从而引发食品安全问题，必须引起相当的重视。因此在实际生产中要科学地使用敏感性抗菌药物进行疾病治疗，预防耐药性菌株的产生，同时积极改善养殖水体环境，增强鱼体抵抗力。

表1 寄鱼不动杆菌（Acinetobacter piscicola）LW15 药物敏感结果Table 1 Antibiotics sensitivity of Acinetobacter piscicola LW15

随着澳洲墨瑞鳕工厂化养殖的发展，其养殖过程中产生的疾病也呈不断上升趋势，主要疾病的发现及防治已成为产业发展的关键。本研究为澳洲墨瑞鳕源寄鱼不动杆菌病害的防治和澳洲墨瑞鳕高密度循环水健康养殖产业化积累了科学资料。