基于网络药理学的血必净注射液干预细胞因子风暴辅助治疗重症新型冠状病毒肺炎的潜在机制研究

吉米丽汗·司马依，买买提明·努尔买买提，艾尼瓦尔·吾买尔，买尔旦·玉苏甫，卡依赛尔·阿布都肉苏力，木哈待斯·努尔，努丽比亚·买合木提，周文婷*

1新疆医科大学药学院；2新疆医科大学维吾尔医学院，乌鲁木齐 830011

2019年12月，在武汉市暴发新型冠状病毒肺炎疫情。2020年2月世界卫生组织(WHO)宣布，新型冠状病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19(corona virus disease 2019)。截止到2020年3月25日国内外已有33万多名确诊病例。患者有严重的急性呼吸系统(SARI)症状，包括发烧、呼吸困难、乏力、咳嗽和肺炎等[1]。研究表明，COVID-19 患者炎症反应增强，重症患者相比轻症患者，血浆多种促炎因子表达水平明显更高，认为“细胞因子风暴”是COVID-19主要的致病机制之一[2]。细胞因子风暴(cytokine storm)指的是高浓度的不受控制的细胞因子释放，是引起急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭的重要因素。

从疫情发生后，国家卫生健康委联合国家中医药管理局在《关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)的通知》中要求加强中西医结合，并推荐了多个中成药在诊治过程中使用，建立中西医联合会诊制度，尽量早期进行中医药治疗，以共同促进COVID-19临床疗效的提高。其中血必净注射液为《诊疗方案》中推荐使用的中成药，用于COVID-19重型、危重型患者治疗。血必净注射液(Xuebijing injection，XBJI)是纯中药制剂，由红花、赤芍、川芎、丹参和当归等5味中药提取制成，在防治细胞因子风暴方面具有一定的科学依据和临床基础[3]。研究报道[4]，对20例重症肺炎合并脓毒症患者进行研究，结果显示应用血必净注射液治疗效果确切。还有研究报道[5]，对126例老年重症肺炎合并呼吸衰竭患者进行研究，发现在常规治疗基础上联合使用血必净注射液能显著改善患者肺部氧合功能，提高临床疗效。因此，本文运用网络药理学方法分析血必净注射液干预细胞因子风暴密切相关的信号通路和潜在靶点，从而防治COVID-19，提高中医药治疗重症COVID-19患者的参与度提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 血必净注射液活性成的收集及筛选

XBJI的5味草药通过TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，TCMID数据库(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)进行成分的收集。收集所得的所有化学成分通过TCMSP分析平台的药物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)ADME参数的限制对其中可能的活性成分进行筛选、做进一步分析。DL是与良好的临床疗效相关联的物理化学性质及生物学特性。DL越大，则成药性越高。Lipinski指出，类药化合物系具有在人体药代药动学过程中表现为较好的ADME特性和安全性，是综合了药代动力学性质与药物的安全性的指标[6]。对于通过口服途径给药的药物，OB 是最重要的药代动力学参数之一，是衡量药物进入人体循环系统有效性的一个重要指标。良好的口服生物利用度是化合物具有药理活性的基本前提之一。以系统药理学方法来分析传统中医药时，OB≥30和DL≥0.18为筛选生物活性成分的标准[7]。

1.2 活性成分对应的作用靶点的预测及筛选

首先，通过TCMSP数据库收集活性成分对应的靶点。然后，将所有靶点通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)以“homo sapiens”(人属)为关键词进行基因-蛋白名称转化，即将全部蛋白名称转换为基因名称。

1.3 细胞因子风暴相关靶点的筛选及其与血必净共有潜在靶点的筛选

利用 “cytokine storm” 作为关键词，对CTD数据库(http://ctdbase.org/)进行已知的细胞因子风暴相关靶点的检索及筛选，并删除检索结果中重复的靶点。此靶点与XBJI活性成分的靶点映射后得到共有的潜在靶点。通过Cytoscape3.7.1软件(https://cytoscape.org)构建草药-潜在成分-潜在靶点网络图(herb-potential compound-potential target，HB-pC-pT network)。

1.4 GO基因功能和KEGG通路分析

以上得到的XBJI干预细胞因子风暴的潜在靶点通过DAVID6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因功能(GO)和信号通路分析(KEGG)。

2 结果

2.1 血必净注射液活性成分分子库筛选及其靶点的预测

XBJI的5味草药通过TCMSP，TCMID和BATMAN-TCM数据库共收集到925个成分，其中红花201个、赤芍138个、川芎192、丹参218个和当归176个(表1)。并将成分通过OB≥30和DL≥0.18筛选，并删除重复的成分后得到71个活性成分，XBJI活性成分ADME的基本信息见表2。以上得到71个活性成分通过TCMSP数据库筛选其对应的1 132个相关靶点，将靶点通过Uniprot数据库进行基因名称-蛋白名称转换，并删除重复的靶点名称后得到241个作用靶点。

表1 XBJI 5味草药的总成分

表2 XBJI活性成分的ADME筛选

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

2.2 细胞因子风暴相关靶点的筛选及其与血必净注射液共有潜在靶点的筛选结果

通过CTD数据库以“cytokine storm” 作为关键词筛选得到与细胞因子风暴相关的83个靶点。此靶点与241个XBJI活性成分的靶点进行映射得到27个共有的潜在靶点(图1)。从Cytoscape3.7.1软件构建的成分-靶点网络中，得到作用于27个潜在靶点的17个潜在成分。并构建5个草药-17个潜在成分-27个潜在靶点网络图(HB-pC-pT network)，如图2所示。该网络由49个节点(5个草药、17个潜在成分和27个潜在靶点)和100个边缘组成。HB(绿色八角形)、pC(黄色四角形)和pT(红色圆形)之间的边缘代表相互作用。一个节点度(degree)代表在蛋白相互作用网络中与该节点直接相互作用的节点的数目。节点的大小与度数成正比。节点的度越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强[8]。从潜在成分的角度分析，其中degree排在前5位的有槲皮素(degree=25)、木犀草素(degree=13)、山奈酚(degree=11)、β-胡萝卜素(degree=8)和黄芩素(degree=7)。从潜在靶点的角度分析，degree≥5的靶点分别为CASP3、RELA、GSK3B、IL-6、IL-1β、TNF、IL-10。结果表明，以上潜在成分及其潜在靶点节点度越大则其参与的生物功能越多，其生物学重要性越强。以上结果可以看出来，血必净注射液中存在一个成分与多个靶点作用，同时也存在不同成分共同作用于同一个靶点的现象，这体现了中药多成分与多靶点之间共同作用的机制。草药中丹参与活性成分的关联网络最多(degree=9)，是血必净注射液的主药。近期研究报道，丹参为活血化瘀的代表药，其抗炎机制符合新冠病毒引发细胞因子风暴的病理特点，使用丹参进行组方将有利于抑制新冠肺炎炎症发展并改善肺部微循环[9]。

图1 血必净注射液和细胞因子风暴共有潜在靶点韦恩图Fig.1 The venn diagram of cytokine storm and XBJI common potential targets

图2 草药-潜在成分-潜在靶点网络图Fig.2 HB-pC-pT network

2.4 GO基因功能和KEGG通路分析结果

为了系统地解释XBJI辅助治疗COVID-19的作用机制，将27个潜在靶点通过DAVID数据库进行GO基因功能和KEGG信号通路分析结果显示，作用靶点涉及到214条目生物过程(biological process，BP)、32条目分子功能(molecular function，MF)、16条目细胞组分(cellular component，CC)(见图3)以及86条KEGG信号通路。KEGG信号通路按照FDR(错误发现率，FDR≤0.01)大小进一步筛选，FDR表示在富集分析中越小，就代表富集显著程度就越高。以FDR≤0.01为标准筛选得到8条主要信号通路以及参与的21个潜在靶点，如图4所示。其中FDR最小的通路是TNF信号通路。

图3 血必净注射液的GO基因功能分析Fig.3 GO analysis of the target of XBJI active components

图4 血必净注射液的信号通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of the target of XBJI active components

3 讨论

2019年12月以来，细胞因子风暴再次进入了人们的视线，其发病机制复杂、疾病进展迅速、死亡率较高。细胞因子风暴起源于抗原刺激，在正常情况下，机体通过“正反馈”调节对抗外界来的病原体，抗原信号传递给免疫系统的信号减弱，细胞因子释放就会开始减少，从而形成“负反馈”(负循环)调节[10]。而细胞因子风暴的本质是免疫紊乱，当凶猛病毒入侵机体时，比如此时正在暴虐的SARS-CoV-2感染等，因免疫调控网络失衡、负反馈的缺失和正反馈的不断自我放大，人体免疫系统会释放大量的细胞因子，这使细胞因子信号变大。细胞因子风暴的后果是组织损伤，即细胞因子信号的变大，可能会导致机体免疫调控网络失衡，引起细胞因子风暴而导致疾病恶化[11]。对以上后果的防治应以早期干预为主，中医药在此方面有着独到的优势。

目前，对于SARS-CoV-2 感染及其引起的细胞因子风暴还没有特效药物。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》指出，对于重型、危重型病例的治疗，主要有呼吸支持、循环支持、康复者血浆治疗，必要时酌情使用糖皮质激素，可使用血必净注射液和肠道微生态调节剂。中医药具有多靶点效应和整体调理作用，部分组分具备一定程度的抗菌抗病毒效果，其抗病毒的研究要注重整体效应，不仅单从某一个指标来解释，更加考虑各指标或因子间的相互作用，以整体调节作用有助于从源头阻止细胞因子风暴的产生[12]。研究报道[13]，血必净注射液对甲型H1N1病毒感染重症肺炎小鼠的脏器保护作用。此外，用于治疗老年重症肺部感染可明显改善患者高凝状态，降低炎症因子水平，调节免疫功能，有效保护患者的肺脏功能和组织结构，以减轻肺损伤，可纠正机体的“过度免疫”，从而有利于控制疾病向“细胞因子风暴”发展[14]。

细胞因子包括促炎细胞因子如IL-6、IL-2、IL-8、IL-1β、TNF-α和抗炎细胞因子如IL-4、IL-11、IL-13、IL-10、IL-1。这两者之间平衡是维持机体的正常免疫功能和抵抗疾病的关键因子。从HB-pC-pT网络结果可以看出来，IL-6、IL-1β和TNF-α促炎细胞因子以及IL-10抗炎细胞因子等靶点在血必净注射液干预细胞因子风暴方面生物学功能比较强。据《柳叶刀》论文报道，在早期的99个病例中，17个COVID-19患者出现了由细胞因子风暴造成的肺毛细血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞的弥漫性损伤而导致ARDS的发生，病情短期内出现恶化，伴随呼吸衰竭并最终多器官衰竭致死，共有11例死亡[15]，临床发现大量升高的细胞因子主要为IL-6、TNF-α、IFN-γ等[16]。有学者发现，SARS-CoV-2的患者也有大量的IL-Iβ、INF-γ、IP-10和MCP-1。SARS-CoV-2感染同时也导致了抑制炎症的IL-4和 IL-10的分泌增加[17]。研究报道，血必净注射液通过下调IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子以及上调IL-10抗炎细胞因子而发挥明显的抗炎作用，并通过影响机体免疫细胞的数量来调节免疫功能，可有效保护患者的肺脏功能和组织结构，以减轻肺损伤[18,19]。又研究报道，槲皮素和芍药苷会下调IL-6、IL-1β和TNF以及上调IL-10而发挥抗炎作用[20-22]。而本研究结果表明，血必净注射液活性成分中槲皮素和芍药苷主要作用于IL-6、IL-1β、TNF和IL-10，这与前期研究报道相符合。

KEGG信号通路结果表明，TNF信号通路的FDR最小，说明TNF信号通路是血必净注射液干预细胞因子风暴的主要信号通路，其次是T细胞信号通路。研究报道，血必净注射液能下调对T细胞增殖和分泌功能的抑制效应[23]。由此可见，血必净注射液主要通过上调调节性T细胞、促进IL-10分泌、下调TNF-α、IL-6、IL-1β调节机体免疫功能，纠正机体的“过度免疫”，有利于控制疾病向“细胞因子风暴”发展。本文研究血必净注射液与细胞因子风暴的关联网络，探讨其辅助治疗重症COVID-19相关的作用路径和潜在的机制靶点，为临床治疗提供有价值的用药指导。