不同产地桔梗HPLC指纹图谱及化学模式识别研究

张 迟，黄戎婕，曾金祥*，钟国跃，韩风雨，于秀玲

1江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，南昌 330004；2内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，赤峰 024000

桔梗为重要的药食两用大宗药材，来源于桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根，临床常用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓等[1]。该种分布广泛，在南至我国的两广、西至川西，东至日本、朝鲜，北至西伯利亚地区均有分布。桔梗在我国东北、华东、华中、西南等地多有栽培，现药材也主要来自于栽培生产，以内蒙古赤峰市的种植面积最大，常年种植面积约5～7万亩，其产量约占全国总产量的50%～60%。既往研究表明，桔梗中含有皂苷、黄酮、酚酸类等多类成分，其中皂苷类成分系桔梗镇咳祛痰的主要活性成分，目前已从桔梗中分离得到70余种皂苷类化合物[2-6]。

因此，基于桔梗主要皂苷类成分构建科学合理的桔梗药材质量控制方法对于其临床应用及新药开发极为必要。既往研究多数侧重桔梗化学成分的分离以及测定其中极少数几个皂苷类成分[7-11]，部分研究或以配备蒸发光散射检测器的高效液相色谱构建指纹图谱[12-14]，但未见以高效液相色谱联合紫外-可见光检测器构建指纹图谱并结合化学模式识别对桔梗质量控制和品质评价进行探讨的报道。因此，本研究建立桔梗的HPLC指纹图谱，并首次结合相似度评价、聚类分析、主成分分析以及正交偏最小二乘判别分析等多种模式识别方法对桔梗质量控制和品质评价进行探讨。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配备PDA紫外-可见光检测器(日本岛津公司)；KQ-5200DB型超声清洗机(昆山市超声波仪器公司)；CP-214电子天平(上海奥豪斯有限公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士步琪公司)；DZKW-S-6型电热恒温不锈钢水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；DHG-111型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.2 试剂

甲醇、浓氨水、正丁醇(分析纯，西陇化工股份有限公司)；乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司)；超纯水(实验室自制)；对照品桔梗皂苷D3(批号：P23N8F48914)、去芹糖桔梗皂苷D3(批号：P15N8F48398)、桔梗皂苷D2(批号：P15N8F48273)、桔梗皂苷D(批号：Z08J9L52294)购自于上海源叶生物科技有限公司；去芹糖桔梗皂苷D(批号：PRF8032746)购自于江西本草天工科技有限公司；以上对照品纯度均≥98%；远志皂苷D2、远志皂苷D为实验室自制，纯度均≥95%。部分桔梗皂苷结构信息见表1和图1。

表1 桔梗皂苷结构信息

图1 母核类型Fig.1 Parent nucleus

1.3 药材

桔梗药材共15批，采集或收集于内蒙古、山东、河北、陕西、吉林、重庆、甘肃等7省市区(其中3批为野生样品)，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.的干燥根。内蒙古赤峰产区样品因气候条件原因，药材采挖后遵循产地初加工工艺，摊开任其自然晾干(耗时较长)；其它产地样品通常在采挖后直接晒干。样品信息见表2。

表2 桔梗样品信息

2 方法和结果

2.1 色谱条件

YMC Hydrosphere C18分析色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～40 min，15%～25% B；40～80 min，25%～30% B，流速0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温35 °C，进样量10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液制备

参照中国药典方法[1]略微改动，取桔梗粉末(过二号筛)约2 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置水浴上蒸干，残渣加水20 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，定容至5 mL。分析前过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称定桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D、远志皂苷D2、远志皂苷D对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.25、0.34、0.46、0.97、3.19、0.65、0.30 mg/mL的混合溶液，备用。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度实验

取S1样品，按“2.2.1”项下处理供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以12号色谱峰为参照峰，计算色谱图中各共有峰相对保留时间的RSD<0.13%，相对峰面积的RSD<1.61%。结果说明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.3.2 稳定性试验

取S1样品，按“2.2.1”项下方法处理供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件分别在 0、4、8、12、16、24、48 h进样，记录色谱图。以12号色谱峰为参照峰，计算色谱图中各共有峰相对保留时间的RSD<0.10%，相对峰面积的RSD<2.38%。结果表明供试品在48 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取S1样品，按“2.2.1”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图。 以12号色谱峰为参照峰，计算色谱图中各共有峰相对保留时间的RSD<0.87%，相对峰面积的RSD<2.73%。结果表明供试品制备方法重复性良好。

2.4 桔梗药材HPLC指纹图谱及技术参数

2.4.1 指纹图谱的建立

取15批桔梗药材，按“2.2.1”项下方法制备供试品，在“2.1”项下的色谱条件进行分析，记录色谱图，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”对不同产地15批次桔梗药材的指纹图谱进行数据分析，设置S1为参照图谱，采用中位数法并进行自动匹配，生成15批桔梗药材的HPLC指纹图谱及共有模式对照图谱(见图2和图3)。

图2 15批桔梗药材的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of 15 batches of Platycodins Radix

图3 桔梗药材的共有模式对照图谱Fig.3 Reference fingerprint of Platycodins Radix

2.4.2 特征峰的标定

根据保留时间标定特征指纹峰，对15批桔梗HPLC指纹图谱测定结果进行比较分析，发现21个特征峰是15批桔梗共有的，因此确定这21个峰为特征指纹峰，共有峰的峰面积总和大于总峰面积的90%。通过对照品比对，确定14号峰为桔梗皂苷D3，16号峰为去芹糖桔梗皂苷D3，17号峰为去芹糖桔梗皂苷D，18号峰为桔梗皂苷D2，19号峰为桔梗皂苷D，20号峰为远志皂苷D2，21号峰为远志皂苷D。桔梗药材样品和混合对照品的HPLC图谱见图4。以峰面积较大、峰形较好且保留时间居中的12号峰作为参照峰，计算其他各共有峰和参照峰的峰面积比值即相对峰面积，结果见表3。

表3 15批桔梗指纹图谱中共有特征峰的相对峰面积

表4 15批桔梗指纹图谱相似度评价

续表4(Continued Tab.4)

2.4.3 相似度评价

将不同产地15批次桔梗药材的指纹图谱导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”对相似度进行评价，结果见表4。15批桔梗与对照指纹图谱相比较相似度都在0.9以上，介于0.927～0.991之间，表明各产地间的桔梗有较高的一致性。

2.5 聚类分析

采用SPSS 25 统计软件对桔梗进行聚类分析，将15批桔梗的相对共有峰峰面积导入到SPSS 25 统计软件，以组间连接法及皮尔逊相关性作为分类依据获得分析结果(见图5)。当分类距离为20时，15批桔梗分为两类，S6、S13、S15三个野生样品聚为一类，其余各地的栽培品种聚为一类，这提示野生生长的桔梗和人工种植的桔梗存在一定的差异。当分类距离为15时，15批桔梗样品分为三类，即3个野生样品为一类，S11和S12聚为一类，其余产地样品聚为一类。

图5 聚类分析结果Fig.5 Results of hierarchical cluster analysis

2.6 主成分分析

采用SPSS 25 统计软件对桔梗进行主成分分析，将15批桔梗药材共有峰峰面积经过SPSS标准化处理后，计算相关矩阵的特征值即方差贡献率，结果见表5。以特征值大于1为提取标准，得到了4个主成分的累计方差贡献率为90.275%，能够较好的代表指纹图谱中的大部分信息，矩阵结果见表6。由结果可知，第一主成分的信息主要来源于色谱峰4、6、9、13～21；第二主成分的信息主要来源于色谱峰3～8、11和12；第三主成分的信息主要来源于色谱峰1、2、10～12；第四主成分的信息主要来源于色谱峰7、10～12、14。利用SIMCA 14.1分析软件绘制主成分分析得分图，见图6。15批桔梗被分为明显的3类，S11和S12位于图的上方分为一类；S6、S13和S15位于图的右下方分为一类；其余样本基本位于图中央的位置分为一类，PCA结果与聚类分析基本一致，也进一步验证了聚类分析的分类结果。

2.7 正交偏最小二乘判别分析

正交偏最小二乘判别分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)是常用来处理分类和判别问题的一种有监督的判别分析法。采用SMICA 14.1对不同产地的15批桔梗药材共有峰峰面积进行OPLS-DA分析，OPLS-DA拟合的模型R2X=0.811，R2Y=0.972，Q2=0.683，均大于0.5，表示拟合的模型稳定可靠，并具有较好的预测性，可以作为桔梗指纹图谱的模式识别方法。15批桔梗的OPLS-DA得分图见图7。另外，以变量投影重要性(variable importance in projection,VIP)大于1筛选对分组结果产生较大影响的色谱峰，结果见图8，它们从大到小分别是色谱峰6、5、13、9、8、3、12、18、7、15、20、11和4。

表5 特征值和方差贡献率

表6 主成分初始因子载荷矩阵

图6 主成分分析得分图Fig.6 PCA score figure

图7 OPLS-DA得分图Fig.7 OPLS-DA score figure

图8 OPLS-DA的VIP图Fig.8 OPLS-DA VIP figure

3 讨论

桔梗为药食两用大宗药材，且主要药效成分为桔梗皂苷，其品质评价与质量控制方法研究具有重要意义。本研究构建桔梗主要皂苷类成分HPLC指纹图谱并鉴定了其中7个皂苷成分，结合相似度评价、聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等多种化学模式识别方法，与已有仅以含量测定[7-11]或指纹图谱[12-14]的品质评价与质量控制方法相比，不仅可有效评价桔梗药材品质的一致性，同时还可阐明桔梗药材品质差异形成的主要因素，因而为桔梗的品质评价与质量控制提供了更为丰富的信息。

化学模式识别的数据来源于指纹图谱色谱峰面积，因此指纹图谱的质量直接影响化学模式的分析结果。为构建良好的指纹图谱，本研究对样品的制备方法、检测波长、流动相组成及柱温均进行了考察优化。结果发现，参照2015版中国药典优化的样品制备方法，能够得到数量较多的桔梗皂苷类成分群。考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水及乙腈-磷酸水等流动相体系及不同色谱柱温与检测波长条件，发现以乙腈-水作为流动相，在35 ℃时选用210nm检测波长能够获得基线平稳且色谱峰分离度良好、总体质量较高的指纹图谱。

由结果可知，15批桔梗指纹图谱相似度在0.927～0.991之间，表明各产地间的栽培及野生桔梗在品质上均有较高的相似性。而聚类分析和主成分分析可进一步将15批桔梗样品分成不同类别，说明本研究构建的方法不仅可评价桔梗药材品质的一致性，还可评价桔梗药材的差异性。OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法，常用于判别分析样本的差异性。由实验结果可知6、9、13、18和20号等色谱峰对不同产地桔梗的品质差异具有较大影响。在本研究中聚类分析与主成分分析将野生样品与栽培品种分别聚类，说明野生样品与栽培样品在成分分布上存在一定差异。根据OPLS-DA分析结果考察各样品相对峰面积可知，3个野生样品指纹图谱6号色谱峰相对峰面积介于0.064%～0.088%，高于栽培品种0.012%～0.056%；13号色谱峰的相对峰面积介于0.059%～0.182%，高于栽培品种的0.018%～0.046%；9号色谱峰相对峰面积介于0.044%～0.056%，高于栽培品种0.011%～0.032%；而15号、18号和20号等色谱峰也表现出相同的趋势。因此，这些成分色谱峰峰面积的微小差异可能是导致野生样品与栽培品种聚类不同的主要原因。

总之，本研究采用指纹图谱结合化学模式识别技术对全国不同产地的桔梗样品质量进行探讨与分析，筛选出造成不同产地桔梗差异的标志性成分，为桔梗的质量控制和后续开发提供了科学参考以及实验依据。