高血压患者NPR-C 基因A-55C 位点多态性研究

赵晓丽，岳薇薇，苗文清，钱 净，朱 丹，李穗雯，杨悦林，黎海生，胡大春

（昆明医科大学附属甘美医院检验科，云南昆明 650011）

原发性高血压是最常见的危害人体健康的心血管疾病，是在遗传易感的基础上，多种环境因素综合作用的结果。2018 年《中国高血压防治指南》指出[1]。心脑血管疾病死亡占总死亡人数的40%以上，其中高血压是心脑血管病发病的第一危险因素。高血压病的病因病理机制复杂，其中钠肽家族及其受体起着举足轻重的作用[2-3]。前人及笔者前期的研究均发现高血压患者存在NPR-C 基因A-55C 位点多态性，并影响高血压病的发生，但其在病理机制中的作用并不清楚。NPR-C 基因A-55C 位点处于基因表达调控区，推测该位点多态性有可能影响NPR-C 的表达，进而影响其对配体ANP 的清除，或影响NPR-C 及其配体结合后的信号通路。为此，本研究试图通过对高血压病患者NPR-C 基因A-55C 位点多态性与外周血调节血压相关因素的分析，对上述假设给予证实。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 高血压患者的纳入标准（1） 云南汉族的界定：父系、母系三代均为汉族，均居住云南境内；（2） 高血压的诊断标准：参照2018 年《中国高血压防治指南》[1]，用以下标准筛选:在未使用降压药物的情况下，非同日3 次测量血压，收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa） 和/或舒张压≥90 mmHg；患者既往有高血压史，现正在服抗高血压药，虽血压＜140/90 mmHg，仍诊断为高血压；家庭血压≥135/85 mmHg；动态血压白天平均值≥135/85 mmHg，或24 h 平均值≥130/80 mmHg 诊断为高血压；（3） 高血压患者的年龄在40～80 岁之间；（4） 研究对象个体间无血缘关系。

1.1.2 入选标准 有临床或实验室信息提示为继发性高血压者。

1.1.3 研究对象剔除标准（1） 研究对象的民族界定不清或基本特征指标信息不清者；（2） 观察指标检测失败者。

1.1.4 研究对象的来源 2018 年1 月至6 月选取在昆明医科大学附属甘美医院健康体检、门诊和住院就诊中发现的原发性高血压患者100 例。其中男性48 例，女性52 例；高血压合并冠心病者64例，高血压未合并冠心病者36 例；高血压合并糖尿病者25 例，高血压未合并糖尿病者75 例。

1.1.5 伦理学措施 本研究经昆明医科大学附属甘美医院伦理委员会批准，入选患者已填写知情同意书。

1.2 样本采集与保存

采用含EDTAK2 采血管，经肘静脉采集空腹静脉血2 mL，采血后立即颠倒混匀并标记，将标记好的标本置于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.3 实验试剂

PCR 反应试剂、FastDigest CseI、溴酚蓝为Fermentas 公司产品；DNA Marker # DL500 为Takara 公司产品；琼脂糖为Santaibio 公司产品；TAE 缓冲液为上海创赛科学仪器有限公司产品；DNA 提取液为广州中山达安基因股份有限公司产品；溴化乙锭为上海联迈生物工程有限公司产品；引物由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

1.4 实验仪器

Gel Doc 2000TM 凝胶成像分析系统、MyCycler，Bio-RadPCR 扩增仪；Heraeus 低温高速离心机；Milipore 超纯水机；Power PAC 3000 电泳仪；电热恒温水浴箱；漩涡振荡器。

1.5 实验方法

1.5.1 基因组DNA 的提取 根据试剂说明书使用血液基因组DNA 提取试剂盒快速提取基因组DNA。

1.5.2 引物序列 NPR-C 基因A-55C 引物序列引用文献[4]中的引物，由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

NPR-C 基因A-55C 位点引物序列如下：

F（5'-3'）：CACCGTCAATTACAAACACTTGGA CAAGTCTAAC

R（5'-3'）：CACCCTTCCTCTTTCCTCCCCACT CTTCTCTCCA

1.5.3 目的片段PCR 反应体系和条件 PCR 反应体系：总体积50 μL，含DNA 模板3 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，DreamTaq Green PCR Master Mix（2X） 25 μL，无核酸酶水，21 μL。扩增条件：95℃预变性3 min，96℃变性50 s，58℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环，最后72℃再延伸5 min。

1.5.4 目的片段PCR 扩增产物HgaI 酶切反应体系 采用PCR-RFLP 法对目的片段PCR 扩增产物酶切，反应体系为：无核酸酶水1.5 μL，10×快速限制性内切酶缓冲液2 μL，PCR 扩增产物25 μL，HgaI 酶1.5 μL。将上述体系混匀，离心机快速离心10 s，使反应体系集中，然后37℃水浴30 min进行PCR 扩增产物酶切。

1.5.5 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物分析配制1.5%的琼脂糖凝胶，电压120 V，电泳45 min，取20 μL 酶切产物点样，在凝胶成像仪上观察结果。根据HgaI 酶切片段的数量与长度不同，判断基因型：酶切产物出现105 bp、265 bp 两个片段者判为AA 纯合型；出现88 bp、105 bp、177 bp 3 个片段者判为CC 纯合型；出现88 bp、105 bp、177 bp、265 bp 4 个片段者判为AC 杂合型。

1.6 质量控制

所有观察指标的检测均参加国家卫计委临床检验中心组织的室间质量评价活动，成绩优秀。

1.7 统计学处理

对基因型和等位基因频率分布进行Hardy-Weinberg 平衡检测，当P＞0.05 时，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一蒙德尔群体。

2 结果

2.1 研究对象NPR-C 基因A-55C 位点多态性检测结果

100 例云南汉族原发性高血压患者样本NPR-C 基因A-55C 位点检测结果显示：100 例样本中未检出AA 基因型，检出AC 和CC 基因型，其中AC 基因型25 例，CC 基因型75 例。部分患者目的片段PCR 扩增产物及其酶切片段电泳结果见图1。

图1 基因多态性检测结果Fig.1 Test results of gene polymorphism

2.2 原发性高血压患者NPR-C 基因A-55C 位点基因型和等位基因频率分布

100 例云南汉族高血压患者NPR-C 基因A-55C 位点基因型和等位基因频率分布见表1。结果显示研究对象中CC 基因型频率是AC 基因型频率的3 倍，C 等位基因频率是A 等位基因频率的7倍。各基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P=0.153）。

3 讨论

原发性高血压的病理机制十分复杂。长期血压升高极易引发患者心、脑、肾、大血管等诸多靶器官出现相应病理改变，进而引发严重的心、脑、肾等器官并发症[5]。但目前高血压病尚无治愈措施，临床主要为对症治疗。探索原发性高血压的病因病理机制对治疗和预防该病有十分重要的意义。本课题在前期研究的基础上，进一步探索NPR-C 基因A-55C 位点多态性在原发性高血压中的病理机制中的作用，为阐明原发性高血压病因病理机制提供线索。

表1 高血压病患者NPR-C 基因A-55C 位点基因型和等位基因频率分布［n（%）］Tab.1 The genotypic and allelic distributions of A-55C of NPR-CGene in essential hypertension［n（%）］

国内外有较多有关NPR-C 基因位点多态性与原发性高血压易感性的相关研究报道[6-8]。Ehret G B等人[9]对20 万欧洲人进行关于血压的全基因组关联研究中发现NPR3 基因3，侧翼序列rs1173771 位点多态性与欧洲人原发性高血压易感性相关。Kato等[10]通过对19 608 名具有东亚血统的受试者收缩压和舒张压的全基因组关联研究进行荟萃分析，发现NPR-C 基因rs1173766 位点多态性与东亚和日本人群高血压病易感性相关。Sarzani R 等[4]对84 例患原发性高血压的高加索人进行研究得出NPR-C 基因A-55C 位点的基因型频率为AA（0.035）、AC（0.297）、CC（0.668）。最近一项研究发现在欧洲人NPR3-C5orf23（rs1173771） 与高血压易感性相关[11]。笔者先前用DNA 杂交芯片技术对100 例云南汉族原发性高血压患者和97 例健康人进行了NPR-C 基因A-55C 位点多态性检测，结果显示CC 基因型增加了原发性高血压的易感性，其OR值达3.77[12]。本次研究采用RFLP-PCR 法测定了100 例云南汉族原发性高血压患者NPR-C 基因A-55C 位点多态性，结果显示原发性高血压患者NPR-C 基因A-55C 位点基因型频率分别为AA（0）、AC（0.25）、CC（0.75）；NPR-C 基因A-55C位点等位基因频率为A（0.125）、C（0.875），两次分别检测不同的100 例云南汉族原发性高血压患者该位点基因多态性都没有检测到AA 基因型，提示NPR-C 基因A-55C 位点多态性存在种族差异，但两次研究结果均可提示CC 基因型与原发性高血压易感有关，并与Sarzani R 等[4]的结果相似。

综上所述，较多研究提示NPR-C 基因多态性可能参与了高血压的发生发展[13-15]，但迄今鲜见关于NPR-C 基因A-55C 位点多态性在原发性高血压病理机制中作用的研究报道。本研究结果提示NPR-C 基因A-55C 位点CC 基因型与原发性高血压易感相关，上述结果为NPR-C 基因A-55C 位点突变在原发性高血压中的遗传病理机制的研究提供了有价值的实验室数据。今后我们课题组会在这方面做更深一步的研究。