商洛蕨菜总黄酮体外抗氧化活性研究

张晓文 郑思琪

摘要：以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）为阳性对照，利用紫外-可见分光光度计测定不同浓度梯度的蕨菜总黄酮样品溶液来探究其对1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O-2·）的清除能力以及总还原力，探究商洛野生蕨菜总黄酮的抗氧化活性。当样品溶液浓度达到4.0 mg/mL时，对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子的清除率分别达到55.34%、71.30%、81.00%，总还原力的吸光度为0.735。试验结果表明，商洛野生蕨菜总黄酮具有较强的体外抗氧化活性，其抗氧化活性的强弱与其质量浓度呈正相关关系，在试验浓度范围内，总黄酮的抗氧化活性低于BHT。

关键词：蕨菜;总黄酮;抗氧化活性;自由基

中图分类号： S647.01;TQ914.1;R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）13-0225-03

收稿日期：2019-08-14

基金项目：陕西省教育厅专项（编号：18JK0246）;商洛学院横向科研项目（编号：19HKY003）;陕西省大学生创新创业项目（编号：S201911396025）。

作者简介：张晓文（1980—），女，陜西商洛人，硕士，副教授，主要从事中药学研究。E-mail：510080487@qq.com。蕨菜属凤尾蕨科蕨属多年生草本植物，别称如意菜、龙头菜、拳头菜、商芝等，在我国各地都有分布。蕨菜味道甘甜、性味寒凉，具有清热、滑肠、降气、祛风、化痰的功效，以治疗食隔、气隔、肠风热毒等症为主，对于女子红崩白带、男子咳嗽、泄痢腹痛、发热不退、湿疹等方面有很好的疗效[1]。蕨菜含有多种人体所需的营养成分，例如脂肪、多糖、黄酮、蛋白质、碳水化合物和Ca、Fe、Zn等微量元素[2]，尤其是所含有的多糖、黄酮，有很强的抗氧化活性，药用价值较高。蕨菜含有的黄酮最主要的药理作用是降血脂、抗氧化、清除自由基以及抗衰老，除此之外，还具有降血压、抗突变、保护肝脏、抗动脉粥样硬化、免疫调节、抗血栓、关节疼痛、脱肛、痢疾以及预防麻疹、流感等作用，近年来还发现蕨菜黄酮具有一定的抗宫颈癌和肝癌肿瘤作用[3]。

陕西省商洛市自古以来就有采食蕨菜的饮食文化[4]，传说“商山四皓”因采食蕨菜而长寿。近年来商芝更是作为名菜销往东南亚、日本以及韩国等地。正是由于商洛地区蕨菜资源丰富，具有良好的发展前景和药用及食用价值，所以主要针对该地区蕨菜的抗氧化活性研究，以期为该地蕨菜资源的进一步综合利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜商洛蕨菜购于商洛市集，并经李筱玲药师鉴定为凤尾蕨科蕨属，除掉杂质淋洗，置60 ℃烘箱中干燥，粉碎，过40目筛，贮干燥器中备用。

试剂：无水乙醇（EtOH）、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、盐酸（HCl）、碳酸氢钠（NaHCO3）、氢氧化钠（NaOH）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝[Al（NO3）3]、三氯化铁（FeCl3）、双氧水（H2O2）、铁氰化钾[K3Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、氮蓝四唑（NBT）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、还原型辅酶（NADH）、吩嗪甲硫酸盐（PMS）、二丁基羟基甲苯（BHT）。试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2主要试验仪器与设备

HYP-150型粉碎机;SPX-250C型恒温恒湿培养箱;超声波提取器;RE-210D型旋转蒸发仪;755B型紫外可见分光光度计;电热恒温水浴锅;超速离心机。

1.3试验方法

1.3.1蕨菜总黄酮的提取准确称取蕨菜粉末 20 g，置于小烧杯中，加入120 mL 70%乙醇，温度为 60 ℃，超声提取3次，每次30 min[5]，滤去残渣，加入活性炭进行脱色处理，按体积比为1 ∶1加入石油醚脱脂，弃去石油醚层，减压浓缩至一定体积，干燥，得到蕨菜总黄酮。

1.3.2DPPH自由基清除能力测定分别取 1 mL 不同质量浓度的蕨菜总黄酮样品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于标记好的试管中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH乙醇溶液，充分混匀，避光静置20 min后[6-7]，以乙醇作空白对照，在517 nm波长处测吸光度（D1），以蒸馏水代替样品液作阴性对照（D2），BHT作阳性对照。

清除率=（1-D1/D2）×100%。

1.3.3羟自由基清除能力测定利用Fenton体系法[8-10]测定，羟自由基在波长510 nm处有最大吸收峰，如果在反应体系中加入有清除·OH能力的物质，与水杨酸竞争·OH，使有色物质生成量减少。在510 nm波长处测定吸光度。分别取1 mL不同质量浓度样品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于标记好的试管中，先后加入 1.50 mL 反应液（含0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L FeCl3和2.8 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7.4）、0.35 mL 20 mmol/L H2O2，加入2.00 mL 6 mmol/L 水杨酸，37 ℃恒温水浴作用40 min后，终止反应，于532 nm波长处测定吸光度（D3），以蒸馏水为阴性对照（D4），BHT作为阳性对照。

清除率=（1-D3/D4）×100%。

1.3.4总还原力测定法分别取1 mL不同质量浓度样品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于标记好的试管中，依次加入2.5 mL PBS（pH值为6.6）、2.5 mL 1% K3[Fe（CN）6]，混匀后于 50 ℃ 水浴中孵育20 min，再加2.5 mL 10% TCA终止反应，离心5 min，取上清2.5 mL，依次加入 2.5 mL 无水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3[6-7，11]，混匀后于700 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水为阴性对照，BHT为阳性对照。

1.3.5超氧阴离子清除能力测定法分别取1 mL不同质量浓度样品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于标记好的试管中，依次加入 2 mL 0.078 mol/L NBT、2 mL 0.468 mmol/L NADH，最后加入0.8 mL 0.060 mol/L PMS溶液，室温摇匀后，静置10 min，离心5 min[6-7，12]，于560 nm波长处测定吸光度（D5），调零孔用不同质量浓度样品液2 mL、0.8 mL蒸馏水代替PMS溶液调零，用蒸馏水作阴性对照（D6），BHT作阳性对照。

清除率=（1-D5/D6）×100%。

2结果与分析

2.1蕨菜总黄酮对DPPH自由基的清除作用

由图1可知，在一定浓度梯度范围内，蕨菜总黄酮和BHT对DPPH自由基的清除率都呈上升趋势。在1.2～4.0 mg/mL的浓度范围内，蕨菜总黄酮对DPPH的清除能力弱于BHT，当浓度低于 2.8 mg/mL 时，蕨菜总黄酮对DPPH的清除能力迅速增加，但随着浓度的递增，BHT对DPPH的清除能力无明显变化。当蕨菜总黄酮质量浓度为 4.0 mg/mL 时，清除率为55.34%。

2.2蕨菜总黄酮对羟基自由基的清除能力

由图2可知，蕨菜总黄酮与BHT相比，在试验测试的质量浓度范围内，其对羟基自由基的清除能力比BHT弱，可是蕨菜总黄酮对羟基自由基清除能力的增幅却大于BHT。随着蕨菜总黄酮浓度的增加，其清除率也同时增强，当蕨菜总黄酮质量浓度为4.0 mg/mL时，清除率為71.30%，表明蕨菜总黄酮对羟基自由基具有较好的清除能力。

2.3蕨菜总黄酮总还原力的测定

由图3可知，BHT的还原能力比蕨菜总黄酮的总还原力高。当蕨菜总黄酮质量浓度达到 4.0 mg/mL 时，吸光度为0.735，这说明在试验测试的质量浓度范围内，蕨菜总黄酮具有较好的还原能力。

2.4蕨菜总黄酮对超氧阴离子的清除能力

由图4可知，蕨菜总黄酮对超氧阴离子的清除作用与其浓度呈正相关关系，在同一质量浓度下，蕨菜总黄酮对超氧阴离子的清除率低于BHT，在低浓度时，二者清除能力都迅速增加，达到2.0 mg/mL以后，BHT的超氧阴离子清除能力趋于平稳，而蕨菜总黄酮的清除能力仍在增加，在4.0 mg/mL以后，清除力不再增加。这说明在蕨菜总黄酮试验浓度范围内，蕨菜总黄酮具有较强的清除超氧阴离子的作用。

3结论与讨论

通过对商洛地区蕨菜总黄酮的研究发现，商洛蕨菜总黄酮对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子都具有较好的清除能力，说明商洛蕨菜总黄酮具有一定的抗氧化、清除自由基、抗衰老作用。

研究中还发现，在试验质量浓度范围内，蕨菜总黄酮样品溶液质量浓度较小时，其与BHT的清除能力相差较大，但蕨菜总黄酮对自由基的清除率增幅大于BHT。当质量浓度为 4.0 mg/mL 时，蕨菜总黄酮对DPPH自由基的清除率可达到55.34%，对超氧阴离子自由基的清除率达到81.00%，表明商洛蕨菜总黄酮的部分抗氧化能力趋近于BHT，可以作为一种天然抗氧化剂来利用。

陈燕芹等研究蕨菜总黄酮在4.0 mg/mL时对DPPH自由基的清除率为38%[13]，本研究结果表明，商洛蕨菜总黄酮在2.4 mg/mL时对DPPH自由基的清除率就已达到38%，当浓度大于2.8 mg/mL时，清除率增幅变缓。蔡丽等研究表明，黄酮浓度在0.56 mg/mL时就已达到羟基自由基最大清除率，而在1.20 mg/mL之后略有减小[14]，本研究中，总黄酮浓度在1.2 mg/mL时对羟基的清除率仅为10%，此后清除率随浓度增加而增加，当达到 3.2 mg/mL 以后，清除率增幅逐渐减缓，趋于平稳。陈乃东等研究的蕨菜总提物和本试验所测蕨菜总黄酮在1.2 mg/mL时对超氧阴离子的清除率基本相近;在2.4 mg/mL时，陈乃东等研究表明清除率已达到73%[15]。而本研究结果仅为59%，但在试验浓度范围内清除率一直呈增加趋势，在 4.0 mg/mL 时，已达到81.00%。这可能与不同产地蕨菜中总黄酮含量及分离纯化方法不同有关。

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