淫羊藿含药血清中淫羊藿苷的分析及其体外抗肿瘤作用研究

古炽明，詹嫣然，陈艳芬，吕立国，翁湘涛，王树声，陈志强

(1.广东省中医院泌尿外科,广东 广州 510105； 2.广东药科大学中药学院,广东 广州 510006)

中药淫羊藿为小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶。淫羊藿味辛、甘，性温，具有温肾壮阳、祛风除湿功效，现代研究表明其有性激素样作用，还可改善骨代谢、调节免疫、抗氧化损伤、改善血流动力学等[1-2]，近年来虽有不少关于其抗肿瘤作用的报道[3-6]，但用于前列腺癌的治疗存在着一定争议。因此，为了考察淫羊藿抗前列腺癌的疗效，本研究利用体外细胞试验探讨淫羊藿含药血清对前列腺癌PC-3细胞的影响，并且初步明确其有效成分，以期为临床用药和进一步的抗肿瘤作用机制研究提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物及细胞株

SPF级SD大鼠，体质量(200±20)g，雄性，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。前列腺癌PC-3细胞株由广东省中医药科学院惠赠。

1.2 药物及试剂

淫羊藿，玉林本草堂中药饮片有限公司，批号171101，经过李书渊教授鉴定为淫羊藿EpimediumbrevicomuMaxim.；淫羊藿苷标准品，成都曼思特生物科技有限公司，批号489-32-7；色谱甲醇，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20180433；色谱乙腈，阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号K1623001；DMEM培养基，美国Hyclon公司，批号8118087；胎牛血清，Gibco公司，批号42G5174K；0.25%胰酶-EDTA，Invitrogen 公司，批号1869505；DMSO，Sigma公司，批号67-68-5；MTT，Sigma公司,批号20171012。

1.3 主要仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu)；1A7150534高效液相色谱柱(GL Sciences)；SK8200H全自动超声机(上海科导超声仪器有限公司)；AUY120分析天平(Shimadzu)；QYN100-2氮吹仪(上海乔跃电子有限公司)；CKX41倒置显微镜(Olympus)；156081-504恒温CO2培养箱(赛默飞世尔科技)；TDL-80-2B低速离心机(上海安亭科学仪器厂)；ELX800全自动酶标仪(BioTek Instruments)。

2 方法

2.1 淫羊藿水煎液的制备

取500 g淫羊藿饮片，加入6～8倍水浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，用双层纱布过滤水煎液，置于烧杯中；向过滤后的滤渣中再加入6～8倍体积的水，武火煮沸，文火煎煮30 min，过滤，合并2次滤液，浓缩水煎液至质量浓度为1 g/mL备用。

2.2 淫羊藿含药血清的制备

参考文献[7-8]和实验室前期经验制备含药血清，大鼠随机分为空白对照组和淫羊藿高剂量组、低剂量组，每组10只。参照临床成人用药剂量及中药血清药理学给药剂量计算方法[7]计算本实验动物的给药剂量，最终以9 g/kg、4.5 g/kg分别作为淫羊藿高、低剂量组。大鼠按高、低剂量连续灌胃给药7 d，每日1次，空白组灌胃等体积的蒸馏水(10 mL/kg)，第7天灌胃后1 h，大鼠麻醉后取血。取血后在室温静置1 h，4 ℃，3 000 r/min离心15 min，取上清液，56 ℃灭活抗体30 min，最后用0.22 μm微孔滤膜过滤后分装并封口，置于-80 ℃保存备用。

2.3 淫羊藿含药血清中淫羊藿苷成分的测定

血清处理：将上述空白血清和淫羊藿含药血清，冻融后各取200 μL，加入800 μL的色谱甲醇，涡旋2 min，4 ℃下13 000 r/min离心15 min，离心后各取700 μL上清液至另一EP管中，室温下氮气吹干，加入100 μL甲醇∶水(体积比1∶1)复溶，涡旋1 min，室温下13 000 r/min离心10 min，取上清液进行HPLC分析，进样量20 μL。

水煎液处理：将上述煎煮好的水煎液加蒸馏水稀释至质量浓度为0.1 g/mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试样。

对照品制备：精密称取1 mg淫羊藿苷的标准品，精密溶解于色谱甲醇溶液中，得到1 mg/mL的标准品溶液。

色谱条件：Inertsil®ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为35 ℃；流动相：A液为乙腈，B液为纯水；等度洗脱程序：0～25 min，28%乙腈，体积流量：1 mL/min；检测波长为220 nm；进样量：10 μL。

观察各样品进样后的出峰时间，和对照品的HPLC图进行比较，分析淫羊藿苷成分是否为淫羊藿水煎液的入血成分。

2.4 前列腺癌PC-3细胞的培养

按常规方法复苏PC-3细胞，接种于DMEM完全培养基中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和链霉素)，置于5%(φ)CO2、37 ℃的CO2培养箱中常规培养、传代。每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状况，拍照记录细胞形态变化。

2.5 MTT法检测淫羊藿含药血清对PC-3细胞增殖的影响

参考实验室前期含药血清的细胞试验方法[8]，收集对数生长期的细胞，0.25%胰酶-EDTA消化后1 000 r/min离心5 min收集细胞，用血球计数板计数，将细胞悬液浓度调整至105个/mL，接种于96孔板，每孔加入200 μL细胞悬液，置CO2培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，吸去旧培养基，在含有相同数量PC-3细胞的96孔培养板中分别加入不同体积的淫羊藿含药血清以及空白血清，使得血清终浓度为2.5%、5%、10%、15%。每个浓度设置3个平行孔，分别继续培养12 h、24 h、36 h、48 h后，弃去含药血清培养基，每孔在避光条件下加入MTT溶液(5 mg/mL)，于培养箱中继续培养4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，在摇床上低速摇匀10 min，沉淀溶解后，置于酶标仪上于490 nm处测定各孔的吸光度(A)。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 淫羊藿含药血清中淫羊藿苷的确定

由图1B可知，淫羊藿苷在17.796 min处出峰。对比空白血清色谱图可发现在该时间点基线较为平稳，无色谱峰出现，而淫羊藿水煎液(图1A)、淫羊藿含药血清(图1D)在该处均有出峰现象。在此情况下，进一步在淫羊藿含药血清中加入适量淫羊藿苷标准品，进样得到图1E，相较于淫羊藿含药血清的HPLC图1D，在17.976 min处色谱峰有所增长，因此可推断淫羊藿苷为淫羊藿的入血成分。

3.2 淫羊藿含药血清对PC-3细胞生长状态的影响

结果发现4个时间点，淫羊藿含药血清组相较于空白血清组均有抑制作用，存在一定的剂量依赖性和时间依赖性，高剂量各浓度组相比低剂量各组别，细胞密度会更小些，死亡细胞略多。随着给药时间的延长，与空白组血清比较，细胞形态发生明显改变，细胞皱缩、细胞体积缩小、细胞密度明显减少。结果见图2A-D。

A.淫羊藿水煎液； B.淫羊藿苷标准品； C.空白血清； D.淫羊藿含药血清； E.淫羊藿含药血清与淫羊藿苷标准品混合。

A.B.C.D分别为给药12 h、24 h、36 h、48 h。

3.3 淫羊藿含药血清对PC-3细胞增殖能力的影响

MTT实验结果表明，与空白血清组比较，含药血清处理12～48 h后，淫羊藿含药血清对PC-3细胞增殖有不同程度的抑制作用，其中尤以36 h作用比较显著，高、低剂量各浓度含药血清的A值均明显低于空白血清组，高剂量组15%含药血清的细胞增殖抑制率达20%以上，提示淫羊藿含药血清可明显抑制PC-3细胞增殖。结果见表1。

表1 淫羊藿含药血清对PC-3细胞增殖的影响Table 1 Effect of Epimedii Folium medicated serum on PC-3 cell proliferation

4 讨论

前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，多发于老年男性，据报道目前在世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第2位[9]。近几年来，中国的前列腺癌发生率增长较快，已经成为严重威胁我国老年男性泌尿系统健康的恶性肿瘤。目前，临床上对前列腺癌的治疗方法主要有：早期可采用根治性治疗方法，如放射性粒子植入、根治性前列腺切除术、根治性外放射治疗；中期采用综合治疗方法，如手术结合放疗、内分泌治疗结合放疗等；晚期则几乎所有患者最终都会发展为激素非依赖性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌，传统治疗方案是去势治疗，包括药物去势和手术去势。随着中医药抗肿瘤研究的推进，中医治疗前列腺癌的优势也逐步体现出来，例如中医药在增加患者免疫功能，延长生存期；减轻放化疗的不良反应；抑制前列腺癌骨转移，提高患者生存质量等方面都有积极的作用。

前列腺癌多发生于老年男性，年老体虚是根本原因之一，多数患者发现时已属晚期转移，正气大虚导致病邪“长驱直进”。因此，本院结合多年的临床经验提出了扶正抑瘤法治疗前列腺癌的治则，明显改善了晚期前列腺癌或激素非依赖性前列腺癌患者的临床症状。近年来“从肾论治”在临床上应用取得了良好疗效，实验研究也发现扶正抑瘤方或补肾抑瘤汤均有体外抗前列腺癌细胞增殖、凋亡的作用[8,10]。作为补肾抑瘤汤中的补肾药淫羊藿及其有效成分淫羊藿苷已被证明对于人肝癌、肺癌、鼻咽癌等多种癌细胞的增殖有抑制作用，但由于其性激素样作用，在治疗前列腺癌的临床应用中颇有争议。本研究期望通过实验明确传统的淫羊藿水煎液是否具有抗前列腺癌作用，以及含药血清中是否含有主要化学成分淫羊藿苷。

研究结果表明，淫羊藿含药血清可明显抑制PC-3细胞增殖，尤以高剂量灌胃获得的15%淫羊藿含药血清作用于细胞36 h比较显著；HPLC检测到淫羊藿含药血清中含有淫羊藿苷。目前已经证实中药淫羊藿含有大量的黄酮类成分，一般认为异戊烯基黄酮及其苷类为淫羊藿的主要活性成分，如淫羊藿苷、朝藿定 A、朝藿定 B 和朝藿定 C等[11-12]。结合研究结果，提示大鼠给药后血清中含有的淫羊藿苷可能是淫羊藿发挥抗前列腺癌作用的主要成分之一，但也不排除存在新产生的代谢产物的抗肿瘤作用。今后可以对淫羊藿进行更深入的血清化学和代谢组学研究，将有助于阐明其作用机制及其物质基础。