湿热因素对蒲公英配方颗粒中咖啡酸稳定性的影响

邓淙友，李定发，蔡林泰，张坚祥，李秀枝，李映娜，吴辉强，王闽予

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand. -Mazz.)为多年生菊科蒲公英属草本植物，是一种应用广泛的药食同源植物。蒲公英全草入药，现代研究表明蒲公英的化学成分主要是多糖类、萜类、有机酸类、总黄酮类等，具有抗癌、抗肿瘤、抗氧化性、清除自由基和抑菌等多种药理作用，临床上主要用于治疗胃溃疡、胃炎等疾病[1-4]。

蒲公英配方颗粒由蒲公英药材经炮制成饮片后，采用提取、浓缩和制剂工艺精制而成，有效成分为水溶性成分咖啡酸。李双等[5]研究表明咖啡酸在水溶液中不稳定，且在高温和光照条件下易被氧化降解。由于中药配方颗粒仍处于国家试点阶段，各生产企业的生产工艺不尽一致，而且2015年版《中国药典》对蒲公英的炮制工艺也未作详细规定。蒲公英配方颗粒生产过程中经常出现咖啡酸质量分数差异较大的现象，这是由于生产企业炮制工艺差异、生产过程控制，还是其他原因引起，目前还不明确。本研究旨在探讨咖啡酸在蒲公英配方颗粒生产过程中水环境下的主要影响因素及变化规律，为蒲公英配方颗粒生产质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪(沃特世公司)；KQ-500DE型超声清洗器(昆山仪器公司)；FE20型PH计(梅特勒-托利多公司)；ME204E万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱(精宏仪器公司)。

咖啡酸(批号：110885-201703，质量分数为99.70%，中国食品药品检定研究院)；甲醇(色谱纯，水为自制超纯水)；甲酸、NaH2PO4等试剂均为分析纯。药材样品经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand.-Mazz.的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液(取NaH2PO31.56 g，加水使溶解成1 000 mL，再加1%磷酸溶液调节pH值至3.8～4.0)(体积比23∶77)；流速：1 mL/min；检测波长：323 nm；柱温：40 ℃，进样量：5 μL。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备

称取咖啡酸对照品5.13 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得咖啡酸对照品储备液(102.29 μg/mL)。精密吸取上述对照品储备液3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成咖啡酸质量浓度为30.70 μg/mL的对照品溶液。咖啡酸对照品图谱见图1。

图1 咖啡酸对照品高效液相色谱图Figure 1 HPLC of caffeic acid reference substance

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 药材样品供试品溶液的制备[6]取蒲公英药材粗粉约1 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入5%(质量分数，下同)甲酸的甲醇溶液10 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定质量，用5%甲酸的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，置棕色量瓶中，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.2 清膏样品供试品溶液的制备[7]取蒲公英清膏约1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入5%甲酸的50%甲醇溶液约45 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，加5%甲酸的50%甲醇溶液补至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，置棕色量瓶中，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取咖啡酸对照品储备液(102.29 μg/mL)1、2、4、6、8 mL，分别置于10 mL量瓶中，再分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成不同浓度的系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量(ng)为横坐标，得到咖啡酸标准曲线为y= 6 307.78x- 738.57，表明咖啡酸在51.1～409.3 ng与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

吸取咖啡酸对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次测定咖啡酸峰面积，计算得其RSD值为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批蒲公英药材(批号FY1902006)样品各6份，按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，分别进样测定咖啡酸峰面积，计算得其RSD为1.52%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取蒲公英药材(批号FY1902006)供试品溶液，分别于0、3、6、8、10、12 h进行测定，结果测得咖啡酸峰面积的RSD值为1.45%，表明样品在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知质量分数的样品(批号:FY1902006，咖啡酸：0.855 mg/g)适量，取约0.5 g，平行6份，精密称定，分别加入咖啡酸对照品0.414 mg，制备供试品溶液。结果得咖啡酸回收率在93%～105%之间，RSD为1.03%，表明方法准确度良好。

2.9 样品质量分数的测定

2.9.1 蒲公英药材水洗供试品的制备与质量分数的测定 取蒲公英药材(批号FY1902006)300 g，平均分成3份，其中2份样品模拟药材前处理生产工序(加入药材质量20倍水，药材在水中快速漂洗，每次洗涤时间为2 min)进行试验，分别进行水洗1次(编号：水洗1)，水洗2次(编号：水洗2)后，沥干水分，置电热恒温鼓风干燥箱中60 ℃烘干6 h；另1份蒲公英药材不进行水洗处理(编号：水洗0)，按同样烘干方法进行平行试验。3份样品烘干处理后分别粉碎，备用。按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果测得蒲公英药材水洗0次、1次、2次的咖啡酸质量分数分别为0.746、0.347、0.267 mg/g，色谱图见图2。

图2 水洗工序下蒲公英药材咖啡酸质量分数变化色谱图Figure 2 Chromatograms of content of coffee acid in Taraxacum under washing process

可见，蒲公英药材经水洗1次后，咖啡酸质量分数降低了约50%，经水洗2次后则降低了约65%，表明生产前处理水洗工序对蒲公英药材咖啡酸质量分数下降有较大的影响。

2.9.2 蒲公英药材水润供试品的制备与质量分数的测定 取蒲公英药材(批号FY1902006)400 g，平均分成4份，其中3份加入药材质量1倍水，在室温中分别放置3 h(编号：水润1)、6 h(编号：水润2)、9 h(编号：水润3)后，按相同的时间与温度(6 h，60 ℃)进行烘干；另一份蒲公英药材不水润处理(编号：水润0)，按同样烘干方法进行平行试验。4份样品烘干处理后分别粉碎，备用。按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。结果测得编号水润0、水润1、水润2、水润3样品中咖啡酸的质量分数分别为0.855、0.474、0.189、0.022 mg/g，色谱图见图3。

图3 水润条件下蒲公英药材咖啡酸质量分数变化色谱图Figure 3 Chromatograms of content of caffeic acid in Taraxacum under water and wet conditions

可见，蒲公英药材在水润条件下放置3 h，咖啡酸质量分数降低了约50%，放置6 h后降低了约80%，放置9 h后降低约97%，表明水润条件下，蒲公英药材咖啡酸质量分数随着放置时间推移呈明显下降趋势。

2.9.3 蒲公英提取浓缩液清膏样品的制备与质量分数的测定 取蒲公英药材(批号FY1902006)100 g，按蒲公英配方颗粒生产工艺进行提取浓缩，得蒲公英提取浓缩液清膏，取约100 mL，置具塞锥形瓶中，精密称定。清膏分别在65 ℃水浴条件下放置0、2、4、6、8 h(分别编号清膏0、清膏1、清膏2、清膏3、清膏4)后补重，分别取样，备用。按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，“2.1”项色谱条件测定。结果测得编号清膏0、清膏1、清膏2、清膏3、清膏4的样品中咖啡酸的质量分数分别为0.192、0.195、0.196、0.195、0.203 mg/g，色谱图见图4。可见，清膏在水浴65 ℃条件下、放置8 h，蒲公英提取浓缩液清膏咖啡酸的质量分数较稳定，无明显变化。

图4 65 ℃加热条件下蒲公英清膏咖啡酸质量分数变化色谱图Figure 4 Chromatograms of content of caffeic acid in dandelion extract by heating at 65 ℃

3 讨论

前处理水洗工序对蒲公英药材咖啡酸质量分数的影响程度主要由加水量、水中滞留时间、水洗次数、水洗方式等因素决定。本研究中虽然水洗0、水洗1和水洗2采用平行烘干，但由于水洗0是在非水润条件下干燥，而水洗1和水洗2是在水润条件下干燥，干燥过程中水润时间对咖啡酸的影响程度较水洗0严重(水润条件下，咖啡酸质量分数也呈下降趋势)，故实际大生产时应严格控制蒲公英药材水洗工序的次数及时间，应采用枪水洗或干洗。

本研究结果显示，水润条件下蒲公英药材咖啡酸质量分数呈持续下降趋势，而提取浓缩液清膏水浴65 ℃条件下、放置8 h，其咖啡酸质量分数却没有明显变化。这可能是由于咖啡酸结构中含有不饱和双键，水润条件下容易被氧化，而清膏在具塞锥形瓶中加热，生产浓缩过程在密闭空间完成，咖啡酸没有直接与氧气接触，难以被氧化，因此质量分数变化较小。

综上所述，蒲公英药材前处理生产工序中水洗次数、水润时间为咖啡酸质量分数下降的主要影响因素，应成为生产过程中质量风险控制的关键点。蒲公英配方颗粒生产最佳方式应采用药材产地趁鲜净制，生产前干洗挑选的工艺。