小鼠黑色素瘤胰腺转移模型的建立及针对肿瘤的控制性实验

胡国章，颜游游,李金梁，宣 巍

(吉林大学中日联谊医院 1.急救医学科；2.心血管内科；3.急诊与重症医学科；4.肝胆胰外科，吉林 长春130033)

黑色素瘤是一种能产生黑色素的高度恶性肿瘤，占皮肤肿瘤死亡病例的绝大部分，多发生于皮肤或接近皮肤的粘膜，也见于软脑膜和脉络膜。该病以白种人的发病率最高，中国虽然不属于高发地区，但是在进入21世纪后呈现逐年上升的趋势。手术切除是其首选治疗方法，尽管术后辅以放疗等辅助治疗，但其远期效果欠佳。采用免疫疗法等新的治疗方法来处理黑色素瘤已经成为一种必要的选择。本实验使用mHSP65与B16黑色素瘤组织的裂解物(B16 melanoma tissue lysates，BTL)制备的mHSP65-BTL作为候选疫苗联合环磷酰胺(cyclophosphamide，CY)用于小鼠黑色素瘤胰腺转移癌模型，观察小鼠的生存期，确认其能否产生抗肿瘤免疫反应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1生物材料 C57BL/6小鼠42只，雌性，6-8周龄，18-22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；C57BL/6小鼠来源的B16黑色素瘤细胞株来自于吉林大学白求恩医学院分子生物教研室；结核分枝杆菌来源的热休克蛋白65(mHSP65)由吉林大学白求恩医学院分子生物教研室保存。

1.1.2实验试剂 RPIM 1640干粉、标准胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶购自Gibco公司；台盼蓝粉末购自中国医药集团上海化学试剂公司；牛血清白蛋白(BSA)购自北京鼎国；青霉素(哈药集团)，强力碘(广东恒健公司)，水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司)，注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药)；实验所用的其它常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3实验器材 100 ml细胞培养瓶(Co Star公司)、平皿、毛玻璃片、300目滤网、组织研磨器、1ml注射器、眼科剪、小镊子、文氏钳、持针器、手术缝合慕丝线、细胞计数板。电泳仪(美国BIORAD公司)、CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)。

1.2 方法

1.2.1B16细胞培养 B16细胞常规培养于含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培养液中，置于5%CO2、37℃孵箱中培养，隔天换液，长满传代。待其生长至对数期时用0.25%胰酶消化，用无血清RPIM1640培养液制备细胞悬液，调整细胞密度至2×104个/ml备用。

1.2.2mHSP65-BTL的制备及鉴定 ①mHSP65-BTL的制备：将B16细胞接种于健康小鼠的四肢皮下，待小鼠四肢膨隆后取出小鼠的黑色素瘤，将肿瘤组织在组织研磨器中反复研磨后制成组织悬液，置于液氮和37℃水浴箱反复冻融5次，2000 rpm 离心10 min，去除沉淀并经滤网过滤后制成BTL。将BTL与mHSP65按20 μg mHSP65+1 mg BTL/ml混合配制即为mHSP65-BTL。②mHSP65-BTL的鉴定:制备后的BTL及mHSP65-BTL用Lowry法检测其中的蛋白含量，并用SDS-PAGE进行鉴定。放于-70度冰箱保存备用。

1.2.3小鼠B16黑色素瘤胰腺转移模型的建立 小鼠术前不禁食水，于手术当日早晨8时分别称取体质量并记录，取10%水合氯醛按0.006 ml/g体重计算药量，给予腹腔注射麻醉。固定小鼠，取仰卧位，以碘伏于左季肋区及左腹部消毒；于左肋弓下寻找脾切迹(皮肤表面略呈蓝紫色)，循该切迹旁线行纵行切口约1.5 cm，分层切开皮肤、腹膜；循斜行的脾脏找到脾脏的尾端，轻柔镊夹将其牵出体外并翻转暴露胰腺体尾部；1 ml注射器吸取制备好的B16细胞悬液后于脾门较宽大处循胰腺走向穿刺入胰腺实质，针尖略向上挑，缓慢推注细胞悬液，待出现白色小泡状隆起后停止注射，每只小鼠注射总量为50 μl，含1×103个细胞，若1个穿刺点注射不足50 μl而已出现囊性小泡时可更换穿刺点多点注射；牵拉腹膜收回胰腺、脾脏；常规关腹，注意止血。创口周围涂抹少量青霉素，见图1。术后常规饲养。

图1 小鼠B16黑色素瘤胰腺转移模型建立的手术过程

1.2.4小鼠体内肿瘤控制性实验 共40只小鼠完成B16黑色素瘤胰腺转移癌模型。观察4天无差别后将小鼠随机分为4组(PBS，mHSP65-BTL，CY，CY+mHSP65-BTL)，10只/组。在接种肿瘤后第4，12天对PBS和mHSP65-BTL组小鼠给予腹腔注射100 μl PBS；CY和CY+mHSP65-BTL组100 μl CY，其中CY：(50 mg/kg)/只。第5，13天对PBS和mHSP65-BTL组的小鼠于下肢靠近淋巴结处注射PBS，mHSP65-BTL；对CY和CY+mHSP65-BTL组的小鼠于下肢靠近淋巴结处注射PBS，mHSP65-BTL，其中mHSP65-BTL用量：(2 μg mHSP65 +100 μg BTL)/只。观察小鼠的生存期，绘制生存曲线。

1.2.5统计学分析 所有实验数据使用单因素方差分析法来进行分析。对于小鼠生存期，采用Kaplan-Meier法进行比较。当P<0.05时认为有统计学差异。所有数据均采用SPSS 16.0统计学软件进行分析处理。

2 结果

2.1 mHSP65-BTL的鉴定(图2)

图2 mHSP65-BTL的鉴定

2.2 小鼠B16黑色素瘤胰腺转移模型建立后行肿瘤控制性实验的生存期(图3)

图3 mHSP65-BTL联合CY作用于小鼠B16黑色素瘤胰腺转移模型的生存曲线

肿瘤接种后观察并记录小鼠的生存期，在进行了30天的监测。结果发现B16黑色素瘤的恶性度非常高，在接种肿瘤后第15天，mHSP65-BTL组就有小鼠发生死亡，所以就只能免疫两次。mHSP65-BTL组和CY组小鼠的生存期与PBS组相比没有统计学意义，而mHSP65-BTL和CY联用组小鼠的生存期显著延长，和PBS组相比有显著统计学意义(P=0.036)。

3 讨论

在本实验中，我们使用了mHSP65与BTL制备的mHSP65-BTL作为候选疫苗免疫胰腺接种B16细胞的C57BL/6小鼠。为了提高疫苗的功效，我们在免疫疫苗前节律性应用低剂量的CY。评估mHSP65-TTL是否可以延长荷瘤小鼠的存活和低剂量CY是否可提高mHSP65-TTL的功效。结果表明，mHSP65-BTL联合使用小剂量CY可以延长荷有B16细胞小鼠的生存期。

黑色素瘤作为一种高度恶性的肿瘤，除了手术治疗及放化疗外，亟需发现并应用一些新的治疗方法。免疫疗法可作为新的选择之一。肿瘤免疫疗法是基于抗肿瘤免疫系统的人工激活，其激活方式包括免疫接种和免疫调节等[1]。

鉴于用肿瘤裂解物(tumor lysate，TL)作为肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的接种方法顾及T细胞对多种TAAs的敏感性及抗肿瘤应答的持续性，它对产生治疗性抗肿瘤应答具有很大潜力[2]。其中，携带TL的热休克蛋白(hot shock protein，HSP)是一种有前途的方法。因为HSP可以携带肽段，激活特异性抗原提呈细胞，并且交叉提呈伴行肽段给MHC I类分子以产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)[3-6]。然而，这种在小鼠上接种HSP-肽段复合物的方法在临床试验的转换中并未获得成功[7]。其中一部分原因可能是未能突破肿瘤介导的免疫抑制。免疫抑制在肿瘤进展中至关重要，而调节性T细胞(Treg)在抑制性环境中的作用是非常突出的，在许多肿瘤中均发现的调节性T细胞数量升高，它的出现预示着较低的生存几率，故需要免疫调节来抑制其发展[8]。

最近临床研究表明低剂量环磷酰胺可以诱导在主动或被动免疫疗法环境中的良性免疫调节效应，抑制调节性T细胞的生长及功能[9]，诱导Th17细胞[10]。环磷酰胺可以选择性诱导体内或体外的FoxP3表达的T细胞死亡，因为FoxP3是一种对低剂量环磷酰胺有更高的敏感性免疫抑制效应相关的转录因子[11]。在小鼠模型中，可以识别表达在正常黑色素细胞及B16黑色素瘤的一种抗原的肿瘤特异性Th17极化细胞可以破坏已建立的黑色素瘤并提高生存率[12]。在黑色素瘤模型中，IL-17缺陷小鼠可以加速肿瘤进程，NK细胞及肿瘤特异性T细胞减少导致的IFN-α释放或肺转移的出现[13]。因此，HSP-TL和节律性使用的环磷酰胺可能是抗黑色素瘤免疫疗法的好策略，本实验研究结果也支持这一观点。

在本实验中，我们将mHSP65-BTL联合环磷酰胺用于小鼠黑色素瘤胰腺转移癌模型中并产生了一定的抗肿瘤免疫反应。这对于临床工作极为重要，在不久的将来，我们可以通过外科手术将肿瘤予以切除，然后将切除的肿瘤制备成肿瘤组织裂解物，并辅以一定量的mHSP65成为肿瘤疫苗，术后配合环磷酰胺予以治疗，这一免疫治疗的组合有可能成为治愈黑色素瘤的新方法。