支气管肺泡灌洗液中miR-17和VEGF表达与低出生体重儿支气管肺发育不良的关系

张珍竹,李晓辉,张宝凤,孙树萍,许 海

(1.日照市中医医院 儿科,山东 日照276800;2.中医药大学黄家湖医院 妇科,湖北430000)

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是接受机械通气治疗早产儿常见的慢性肺部疾病。近年来，随着新生儿科的快速发展，低出生体重儿存活率越来越高，BPD发生率也渐渐升高。低出生体重儿BPD辅助用氧时间长，病死率高，存活患儿易发生下呼吸道感染，若并发肺部感染，在短期内即可导致肺功能失代偿，严重影响患儿正常生长发育。因此，临床应早期诊断BPD，以便及时采取干预措施，从而改善患儿生存质量。微小RNA-17(microRNA-17，miR-17)在呼吸系统、心脏等发育过程中起重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种功能性糖蛋白，具有修复肺组织损伤和调节肺血管发育作用[1]。Huang等[2]研究报道，miR-17与非小细胞肺癌病情程度有关；常明等[3]研究发现，VEGF参与急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征新生儿病情进展，而miR-17、VEGF与低出生体重儿BPD关系尚不十分清楚。且有研究报道[4]，VEGF 165通过抑制miR-17表达可提高内皮祖细胞存活率。鉴于此，本研究通过测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中miR-17、VEGF表达水平，分析其与低出生体重儿BPD关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2016年1月-2019年7月医院新生儿科收治的95例低出生体重儿作为受试对象，根据是否进行机械通气及机械通气是否发生BPD将95例低出生体重儿分为对照组(单纯低出生体重儿)30例、机械通气非BPD组33例、机械通气BPD组32例。对照组有男婴17例，女婴13例；机械通气非BPD组有男婴19例，女婴14例；机械通气BPD组有男婴18例，女婴14例。本研究符合医院伦理委员会标准。入选标准：(1)BPD患儿符合美国多家国立卫生研究机构(NICHD/NHLBI/ORD)联合BPD研究组2001年发布的BPD诊断标准[5]；(2)临床资料完整；(3)患儿家属均知情同意；(4)配合研究。排除标准：(1)患儿未存活；(2)有先天性心脏病、胸腔积液等疾病；(3)中途转院及影响实验结果患儿。三组患儿性别组间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1BALF采集与处理 对照组未进行机械通气和吸氧治疗，机械通气非BPD组、机械通气BPD组均给予机械通气和吸氧治疗。对照组于入院72 h内采集BALF，机械通气非BPD组、机械通气BPD组于机械通气前及机械通气后24、48、72 h分别采集BALF。BALF采集方法：从受试患儿气管插管中注入37℃生理盐水，每次1 mL/kg左右，插入吸痰管后负压吸引(<6 kPa)，转动吸痰管边吸边退，重复此操作3次，收集灌洗液，并1 000 r/min离心15 min，留取上清液保存于-80℃冰箱待测。

1.2.2miR-17水平测定 采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测BALF中miR-17水平，qRT-PCR购自南京贝登医疗股份有限公司。按照miRcute miRNA提取分离试剂盒(购自天根生化科技有限公司)操作步骤提取BALF中小RNA，并反转录得cDNA。miR-17扩增以U6为内参基因，扩增引物序列详见表1。设定反应条件为：95℃，5 min变性；95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，20 s；40个循环。每次反应均设置3个复孔，以保证结果准确性，反应完成后用2-ΔΔCt计算BALF中miR-17相对表达量。

表1 扩增引物序列

1.2.3VEGF水平测定 采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测BALF中VEGF水平，具体操作步骤按照人VEGF试剂盒(购自上海广锐生物科技有限公司)说明书进行。

1.2.4BPD临床分度标准[6]根据胎龄<32周(校正胎龄36周)或胎龄≥32周出院时是否用氧分为：(1)轻度BPD：不需吸氧；(2)中度BPD：需吸氧，氧浓度<30%；(3)重度BPD：需吸氧，氧浓度≥30%或持续气道正压通气、机械通气。机械通气BPD组患儿轻度BPD 10例，胎龄(31.05±3.11)周，出生体重(1623.59±291.60)g；中度BPD 12例，胎龄(30.98±3.07)周，出生体重(1587.03±282.14)g；重度BPD 10例，胎龄(30.22±3.25)周，出生体重(1491.28±266.75)g；三组患儿胎龄、出生体重差异无统计学意义(P>0.05)。均于机械通气72 h后检测BALF中miR-17、VEGF水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0处理三组患儿数据，计数资料用%描述，行检验；计量资料用描述，两组比较行t检验，三组比较行单因素方差分析；利用Pearson分析机械通气BPD组患儿BALF中miR-17、VEGF水平相关性；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患儿一般资料比较

三组患儿胎龄、出生体重差异无统计学意义(P>0.05)；对照组胎龄最长、出生体重最重，其次为机械通气非BPD组患儿，机械通气BPD组患儿胎龄最短、出生体重最轻，组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；机械通气BPD组患儿机械通气时间、吸氧时间均显著长于机械通气非BPD组患儿(P<0.05),见表2。

表2 三组患儿一般资料比较

2.2 三组患儿BALF中miR-17、VEGF水平比较

三组患儿BALF中miR-17、VEGF水平差异有统计学意义(P<0.05)；机械通气BPD组、机械通气非BPD组患儿BALF中miR-17水平显著低于对照组(P<0.05)，机械通气BPD组患儿BALF中miR-17水平明显低于机械通气非BPD组患儿(P<0.05)；机械通气BPD组、机械通气非BPD组患儿BALF中VEGF水平明显高于对照组(P<0.05)，机械通气BPD组患儿BALF中VEGF水平显著高于机械通气非BPD组(P<0.05)，见表3。

表3 三组患儿BALF中miR-17、VEGF水平比较

2.3 机械通气患儿不同通气时段BALF中miR-17、VEGF水平变化

随着机械通气时间延长，机械通气非BPD组、机械通气BPD组患儿BALF中miR-17水平逐渐降低、VEGF水平逐渐提高，且同组不同通气时段两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同通气时段机械通气BPD组患儿BALF中miR-17水平明显低于机械通气非BPD组患儿(P<0.05)，VEGF水平显著高于机械通气非BPD组患儿(P<0.05)，见表4。

表4 机械通气患儿不同通气时段BALF中miR-17、VEGF水平变化

2.4 机械通气BPD组患儿不同程度BALF中miR-17、VEGF水平比较

机械通气BPD组患儿不同程度BALF中miR-17、VEGF水平差异有统计学意义(P<0.05)；重度、中度BPD患儿BALF中miR-17水平显著低于轻度BPD患儿(P<0.05)、VEGF水平明显高于轻度BPD患儿(P<0.05)，重度BPD患儿BALF中miR-17水平明显低于中度BPD患儿、VEGF水平显著高于中度BPD患儿(P<0.05)，见表5。

表5 机械通气BPD组患儿不同程度BALF中miR-17、VEGF水平比较

2.5 机械通气BPD组患儿BALF中miR-17、VEGF水平相关性

机械通气BPD组患儿BALF中miR-17水平与VEGF水平呈负相关(r=-0.699，P<0.05)，见图1。

图1 机械通气BPD组患儿BALF中miR-17、VEGF水平相关性

3 讨论

BPD发生发展与早产、长时间机械通气及感染等有关，其病死率和再住院率均较高，目前尚缺乏有效预防和干预措施。由于BPD发病机制尚未完全阐明，临床应继续寻找与BPD病因相关指标，以达到对BPD早期预防和干预治疗。BALF是利用肺泡表面有效液体检测细胞成分的有效方法，有利于肺部疾病的鉴别诊断。已有研究证实[7,8]，miRNA、VEGF与BPD发生、发展关系密切，因此深入研究BALF中miR-17、VEGF水平及二者在BPD中作用对该病的早期干预有重要意义。

miR-17-92簇是一类具有代表性的miRNA家族，位于人染色体13q31.3，参与多种疾病发展进程。miR-17-92簇是一种高度保守且含有多顺反子启动子的典型基因簇，可产生6个成熟的miRNA，均参与血管生成及免疫系统发育等过程[9]。miR-17是miR-17-92簇中重要成员，具有miR-17-92簇作用，其水平变化与肺动脉高压患者病情严重程度有关[10]。本研究发现，三组患儿BALF中miR-17水平高低依次为：对照组、机械通气非BPD组患儿、机械通气BPD组患儿，提示低出生体重儿BALF中miR-17水平降低可能与长时间机械通气及BPD发生有关。机械通气时间越长，患儿BALF中miR-17水平越低，且不同通气时段机械通气BPD组患儿BALF中miR-17水平明显低于机械通气非BPD组，提示BPD低出生体重儿随机械通气时间延长，肺损伤逐渐加重，动态监测机械通气低出生体重儿BALF中miR-17水平变化，有利于早期诊断BPD。此外，本研究中重度BPD患儿BALF中miR-17水平最低、其次为中度BPD患儿、轻度BPD患儿BALF中miR-17水平最高，提示BPD程度越严重，BALF中miR-17水平越低，可能与机械通气时间长有关。

VEGF定位于人染色体6p21.3，由7个内含子和8个外显子组成，是Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种有丝分裂原，在肺泡发育过程中发挥重要作用[11]。VEGF又称为血管通透性因子，可明显促进血管内皮细胞分裂增生，并可增加血管通透性[12]。在缺氧条件下，机体VEGF含量明显上升，并可通过诱导VEGF转录，间接提高VEGF生理活性[13]。常丽等[14]研究发现，闭塞性细支气管炎患儿血清VEGF水平明显高于对照组患儿，并与患儿病程有关。曹悦鞍等[15]研究报道，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者血清VEGF水平显著高于对照组，血清VEGF水平升高可能是影响患者夜间血压上升的独立危险因子。Robak等[16]研究结果发现，系统性红斑狼疮患者血清VEGF水平显著高于健康对照者。本研究中机械通气BPD组患儿VEGF水平最高、其次为机械通气非BPD组患儿、对照组VEGF水平最低，与常丽等[14]、曹悦鞍等[15]、Robak等[16]研究相似，提示VEGF可能参与低出生体重儿BPD发生。进一步研究发现，机械通气72 h VEGF水平最高、其次为机械通气48 h、机械通气24 h VEGF水平最低，提示机械通气时间长短可能与VEGF水平变化有关；且不同通气时段机械通气BPD组患儿VEGF水平均远高于机械通气非BPD组，提示机械通气时间及VEGF水平可能与BPD病情进展有关。本研究还发现，VEGF水平高低依次为重度BPD、中度BPD、轻度BPD，提示VEGF水平可能与低出生体重儿BPD程度有关。此外，Chamorrojorganes等[17]报道miR-17-92簇可通过抑制ERK/ELK1，增强VEGF信号通路作用，促进内皮细胞血管生成，提示miR-17-92与VEGF可能相互作用参与疾病发展。本研究相关性分析发现，机械通气BPD组患儿BALF中miR-17、VEGF水平呈负相关，提示miR-17、VEGF可能共同参与低出生体重儿BPD发展。

综上所述，BPD低出生体重儿BALF中miR-17水平降低、VEGF水平升高，二者可能共同参与BPD发生、发展，动态监测BALF中miR-17、VEGF水平，对准确判断低出生体重儿BPD程度具有参考意义。本研究仅短期内观察BALF中miR-17、VEGF水平变化，接下来应加大样本观察BPD患儿住院期间及出院后BALF中miR-17、VEGF水平，以期为预后提供依据。