逆转座子LINE-1在脑胶质瘤中异常活化的临床意义

王春辉，孟繁凯，费邵阳，陈 莫，郑林杰

(吉林省人民医院 神经外科，吉林 长春130021)

脑胶质瘤的发病成因复杂、发病机制仍未阐明，临床上既缺乏有效的治疗药物也缺少用于预测中远期预后的标志物[1]。因此寻找脑胶质瘤相关的信号分子一直是研究者关注的热点，长散在重复序列LINE-1(LINE-1)是已知今人体内存在的唯一具有自主转座活性的转座子，约占基因组总量的17%[3]，LINE-1可以两个编码蛋白：ORF1p具有高亲和性的核酸分子伴侣活性，可以保护RNA免于被降解介导核酸蛋白复合物进入细胞核；ORF2p 则同时具有逆转录酶和核酸内切酶活性，参与cDNA的合成[4,5]。早在1988年研究者在乳腺导管癌患者的组织中检测到了由LINE-1的转座而引起的MYC癌基因的重排[6]。近年来，随着二代测序技术的普及和多种LINE-1检测方法的建立及优化，在多种肿瘤和癌变组织中发现了大量LINE-1转座的证据，如结肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和肝癌等[7-10]。这种LINE-1的异常活化通常预示着较差的预后和较深的癌变程度，这提示LINE-1异常激活可能是细胞癌变的诱因之一。由于技术原因导致ORF2的表达水平较低难以检测、目前人们常以ORF1的表达水平，代表细胞中LINE-1的活化状态，由于正常的体细胞中几乎无法检测到LINE-1的mRNA及其所编码的蛋白，LINE-1的ORF-1有潜力成为检测肿瘤恶性程度的特异性分子标志物[11]。本文探讨LINE-1 ORF-1在脑胶质瘤组织中的表达水平及临床意义，报道如下。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

Trazol购自美国Qiagen公司，反转录、qPCR试剂盒均购自Roche公司，引物由库美公司合成，相关引物序列见表1。

表1 引物序列信息

1.2 临床样本来源

肿瘤样本的收集自2013年1月到2015年1月间，就诊于吉林省人民医院神经外科确诊的脑胶质瘤者，共30例，患者术前未接受放疗、化疗等治疗，并全部签署了知情同意书。收集的脑胶质瘤组织和癌旁组织，经液氮速冻后，储存于-80冰箱，以备后续实验使用。相关操作获得了我院伦理委员会批准。

1.3 实验方法

将样本在液氮中研磨粉碎，加入Trizol完全裂解后，提取总RNA；利用Roche公司Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA；Real-time PCR检测LINE-1 ORF1和内参GAPDH基因的mRNA表达情况;以GAPDH为内参基因，数据采用2-ΔΔCT法进行分析:ΔCT=CT(target gene)-CT(internal control);ΔΔCT=ΔCT(test gene)-ΔCT(reference gene);Ratio(fold)= 2-ΔΔCT。

1.4 预后情况随访

预后随访方式为门诊复查、电话随访等，随访时间为患者术后1-60月，无进展生存期为术后至影像学证据证明复发，总生存时间为术后至患者死亡或超过60月。

1.5 统计学分析

采用SPSS录入并比较数据，两组数据间的比较采用t检验，Kaplan-Meier生存曲线比较患者生存率，Log-Rank检验两组间的统计学差异，以P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 脑胶质瘤癌组织和癌旁组织中LINE-1表达水平的差异

qPCR检测逆转座子LINE-1 ORF1在30例脑胶质瘤和癌旁组织中的表达情况，结果表明(图1)，LINE-1 ORF1在肿瘤组织中的表达量为0.0430±0.0287，显著高于癌旁组织中的0.0240±0.0207(P<0.05)。

图1 LINE-1在胶质瘤组织中的表达水平

2.2 脑胶质瘤癌组织中LINE-1表达情况与病理特征的关系

结果(表2)表明，肿瘤的大小、位置与LINE-1 ORF1的表达水平无关(P>0.05)，而在高WHO分级(Ⅲ-Ⅳ级)的胶质瘤中LINE-1 OFR1的表达明显高于低级胶质瘤(Ⅰ-Ⅱ级)，同时在ki-67高表达的胶质瘤组织中，LINE-1的表达水平更高，差异具有统计学意义(P<0.05)

表2 不同病理特征脑胶质瘤中LINE-1表达情况

2.3 不同LINE-1表达情况的脑胶质瘤患者预后情况的比较

将受试患者按照，胶质瘤组织中LINE-1表达水平的中位数分为LINE-1高表达组和LINE-1低表达组，绘制生存曲线，结果表明(图2)，与LINE-1低表达组相比，LINE-1高表达组的生存率显著降低，差异具有统计学意义。

图2 不同LINE-1表达水平的脑胶质瘤患者生存率的比较

3 讨论

脑胶质瘤是最为常见的原发性颅脑恶性肿瘤，具有发病率高、治愈率低、死亡率高等特点，研究者对于脑胶质瘤的发病机制尚不明确，临床上也缺乏有效的治疗手段和预测预后情况的分子靶点。近年来，逆转座子LINE-1在肿瘤发生、发展过程中的作用，引起了研究者的关注。LINE-1的异常活化会对细胞基因组产生重大影响，一方面LINE-1的插入可能会引发癌基因的激活，抑癌基因的失活，成为肿瘤发生的重要诱因[12]，另一方面，LINE-1活化会增加细胞内逆转录酶ORF2p的表达水平，造成microRNA调控网络的紊乱，破坏细胞基因组稳定性，引发各类疾病，而基因组不稳定也是肿瘤细胞的一个重要特征[13]。近年来研究者在多种肿瘤组织均检测到了LINE-1异常活化的证据，例如肾癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌等，这种LINE-1的异常活化通常预示着较差的预后和较深的癌变程度[14,15]。本文中，我们检测了脑胶质瘤癌组织和癌旁组织中LINE-1编码的ORF1的表达情况，结果表明胶质瘤组织中LINE-1的活化程度显著高于癌旁组织，说明逆转座子LINE-1在胶质瘤中同样存在者异常激活，LINE-1的活化很可能破坏细胞基因组稳定性，进而促进了肿瘤细胞的发生、发展。

在确定了胶质瘤组织中存在LINE-1异常活化之后，我们进一步分析了LINE-1的高表达与胶质瘤病理特征及预后情况的关联，在WHO分级为Ⅲ-Ⅳ级的胶质瘤中，LINE-1的表达水平明显高于Ⅲ-Ⅳ级的胶质瘤；在Ki-67高表达的胶质瘤组织，LINE-1 ORF1同样也有着更高的表达，高的分级通常反应了病灶浸润程度，Ki-67代表肿瘤细胞的活力，这些数据都说明LINE-1的活化程度与病理特征的恶化程度直接相关，上述结论与其他研究者在肺癌、白血病等其他肿瘤中的发现类似。通过对患者的预后随访，我们绘制了脑胶质瘤患者的生存曲线，结果表明：LINE-1高表达的患者生存率显著低于LINE-1低表达的患者，这说明LINE-1的异常表达与患者的不良预后相关。考虑到本文选取的样本数量有限，仍需要更多数据论证LINE-1能否成为脑胶质瘤不良预后的分子标志物。

综上所述，逆转座子LINE-1在脑胶质瘤组织中存在异常表达，逆转座子的活化与胶质瘤的病理分级显著相关，同时也是脑胶质瘤患者不良预后的一个显著标志。LINE-1有潜力成为脑胶质瘤诊断、治疗的新靶点。