ApoE基因敲除构建大鼠缺血性脑卒中模型的实验研究

王 雄，邬玉芹，陈 红，张 武，何占平，陈泽谷，夏 鹰，余 丹，陈 晶

(海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院，海南 海口570208)

缺血性脑卒中具有高发病率、高病死率、高致残率的特点，约占脑血管疾病总数的60%-80%，社会负担重[1-5]。缺血性脑卒中的治疗及神经细胞保护是基础和临床研究的重点。脑血管疾病尤其是急性缺血性脑血管疾病的病理生理研究，依赖能模拟临床疾病、重复性好的动物模型。因此，建立能模拟临床疾病、重复性好、稳定性好的动物模型特别重要，以便深入探讨缺血性脑卒中的脑损伤机制、神经保护机制及治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

采用雄性APOE(-/-)基因剔除大鼠100只(购自湖北省疾病预防控制中心)，SPF级雄性SD大鼠100只，年龄约6周龄且体重为0.18-0.22 kg，动物摄食标准饲料和自来水，置于12/12 h光/暗周期环境下24℃安静温控动物房笼中，相对湿度45%左右，每笼3-5只饲养，依据大鼠品系分为2组。

1.2 实验方法

选用健康的6周龄雄性ApoE基因敲除大鼠100只，SPF级SD雄性大鼠100只，依据大鼠种类分为两组。用线栓法堵塞大脑中动脉2 h，缺血后2 h向外拔出线栓约2 mm再灌注22 h后行Zea-Longa评分，评分在2-3分为成功模型。统计不同种类大鼠成模成功率情况；在模型构建3 d、7 d时行神经功能缺损严重程度评分(NSS)和横木行走实验(BWT)评分评估模型的稳定性，同时行核磁共振(MRI)检查了解各处理梗塞病灶范围及变化。

1.3 磁共振成像(T1T2DWIPWI)

数据采集使用美国GE公司signa HDX 3.0 T MR机扫描,上海辰光医疗科技有限公司生产的专用相控阵实验动物线圈(大鼠，5 cm孔径)对大鼠行颅脑MR扫描。扫描时期：大鼠于缺血再灌注后24 h、72 h和7天之后行MR扫描。扫描前利用电子天平对大鼠称重，腹腔注射4%水合氯醛10 mL/kg麻醉大鼠，约5 min大鼠进入麻醉状态，由于扫描时间较长，在扫描过程中大鼠出现清醒迹象适当追加经腹注射4%的水合氯醛水溶液。将麻醉好的大鼠取仰卧位，大鼠头部、腹部分别施加胶带固定于专用相控实验动物线圈上，以视交叉为中心冠状位定位扫描。扫描序列包括：①轴位T2加权序列：FOV60 mm×60 mm×20 mm，体素大小0.288 mm×0.288 mm，层厚1.2 mm，层间距0 mm，TSE 因子13，TR3150 ms，TEl00 ms，平均次数6，翻转角90°。②轴位T1加权序列：FOV60 mm×60 mm×20 mm，体素大小0.268 mm×0.268 mm，层厚1.2 mm，层间距0 mm，15层，TR 340 ms，TE12 ms，平均次数4，翻转角30°。③矢状位T2加权序列。④轴位DWI序列：b值选择1000 s/mm2。⑤PWI序列。缺血24 h后动态观察脑组织影像的变化情况及左右大脑半球的对称情况。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 不同类别大鼠缺血性脑卒中动物模型构建成功率

通过激光多普勒脑血流仪测量大鼠大脑中动脉栓塞后的局部脑血流变化。监测大脑中动脉线栓阻断血流程度，证实模型的成功与否。大脑中动脉血流有阻断现象为建模成功，大脑中动脉血流无阻断现象及脑出血为建模失败；无脑出血大鼠均存活，脑出血者死亡。不同时间点两种MCAO大鼠模型成功率比较：Apo-E基因缺陷大鼠组：缺血再灌注24 h符合Zea-Longa的5分制评分标准2-3分的鼠(成功鼠)82只，1分鼠10只，0分鼠3只，24 h内死亡鼠5只，3日内死亡鼠(包括成功鼠13只)共24只，7日内死亡鼠(包括成功鼠14只)共25只。再灌注24 h内模型成功率为82%，3日内模型成功率为76%，缺血再灌注7日内模型成功率为75%；SD大鼠组：缺血再灌注24 h符合Zea-Longa的5分制评分标准2-3分的鼠(成功鼠)87只，1分鼠7只，0分鼠3只，24 h内死亡鼠3只，3日内死亡鼠(包括成功鼠11只)共23只，7日内死亡鼠(包括成功鼠14只)共27只。再灌注24 h内模型成功率为87%，3日内模型成功率为77%，缺血再灌注7日内模型成功率为73%。不同时点基因缺陷组与SD组MCAO模型成功率均无统计学差异(P>0.05)(表1)，但不论Apo-E组还是WT组的建模成功率随着时间的推移均存在一定程度的下降。

表1 不同时间点两种MCAO大鼠模型成功率比较

2.2 磁共振成像

将两组缺血性脑卒中动物模型均在缺血24 h、72 h和168 h时行MRI扫描，均行MRI-DWI、T2WI、PWI扫描，动态观察不同MR扫描序列不同扫描时间的影像表现情况。在MR-DWI及T2WI图像上均能看到缺血侧与对侧(非缺血侧)影像存在明显差异，经统计学分析发现实验组和对照组在缺血1天、3天和7天缺血脑容积百分比比较均存在统计学差异(P<0.05)；将MRI-PWI图像与DWI图像进行融合后再利用图像处理软件(Image-Pro Plus6.0)测量和计算缺血核心区域、缺血半暗带及总缺血区域的百分比(%)。PWI与DWI融合后处理图像显示缺血核心区域随着时间的推移缺血范围先有所增大然后缩小，缺血半暗带范围逐渐扩大，缺血核心、缺血半暗带及总脑血流量的百分比随着时间推移均有所降低(图1)。将两种缺血动物模型缺血1天和缺血3天的脑缺血容积百分比进行比较(图2、3)，在缺血第3天时两种模型缺血半暗带百分比间存在统计学差异(P<0.05)，而总缺血容积及缺血核心在缺血1天和3天均无统计学差异(P>0.05)。两种脑缺血模型总体MR影像变化特点一致，但SD组较Apo-E基因缺陷组变化明显。

图1 MRI灌注图像与DWI融合后处理图像。红色区域为缺血核心区域，蓝色则为缺血半暗带。

图2 两种缺血性脑卒中动物模型缺血1天脑容积百分比图情况

图3 两种缺血性脑卒中动物模型缺血3天脑容积百分比图情况

2.4 MCAO鼠脑部大体表现TTC染色结果

成功模型脑标本行TTC染色后大多表现为左侧大脑中动脉供血区染成苍白色。部分死亡大鼠(死后立即TTC染色)可见整个左侧半球苍白、肿胀，提示整个颈内动脉系统的缺血。

3 讨论

3.1 缺血性脑卒中动物模型成功率及稳定性评估

评估实验动物模型构建成功率和稳定性评估是构建实验动物模型研究的重要组成部分，针对不同的要求其评估方法也不完全相同。目前脑卒中模型构建成功率及稳定性的评估方法主要有：激光多普勒血流测定、脑神经功能评分、功能磁共振检查、TTC染色实验、免疫荧光染色和蛋白印迹法等。不同评估方法在评估中所起的作用也存在很大的差异。激光多普勒主要应用于观察和检测整个循环系统的血液灌注量、血细胞数和移动速度等血流指标分析，可直接观察大脑中动脉栓塞模型的栓塞情况。神经功能评分主要是通过动物的行为学改变间接评估线栓对动物模型的神经功能的影响情况。随着功能磁共振的飞速发展，MRI已成为缺血性脑卒中的重要诊断手段。大量研究表明MR-DWI及PWI成像能够清晰显示脑缺血的部位及范围[6,7]，特别是能够进行活体动态监测和观察脑缺血的范围变化情况。TTC染色能够很好的确定模型的生物行为学改变是由组织缺血所致。免疫荧光和蛋白分子印迹能够从分子角度评估动物模型的神经功能状况。本研究采用多种方法对构建的缺血性脑卒中动物模型的稳定行稳定性进行评估，取长补短，从行为学、影像学和分子免疫学等多方位全面评估该模型的稳定性，旨在充分肯定其建模效果。

3.2 建模动物的选择

多种脂蛋白中都存在ApoE，ApoE的主要作用是参与脂质物质的转运、储存、利用和排泄，在血浆胆固醇的调节过程中也发挥着十分重要的作用。ApoE是动脉粥样硬化和高血脂等病变发生发展的一个重要的分子靶标。将ApoE基因敲除后可导致富含胆固醇的脂蛋白清除受到障碍，从而使血浆中胆固醇水平明显增高致使大量脂蛋白在机体内蓄积而形成斑块。有研究表明ApoE基因敲除大鼠可自发形成动脉粥样硬化，予以普通饲料喂养至15周龄即可出现典型斑块特征的复杂病变，这与老年患者血管多发斑块的表现及病变过程非常相似，采用ApoE基因敲除大鼠制备动物模型能够更好的模拟人体内病变的发生、发展及转归情况，目前已成为探讨动脉粥样硬化发生、发展机制及研究干预手段的极佳实验动物。研究发现动脉粥样硬化病变局部动脉内膜常出现病理性的血管新生，新生血管可促进粥样硬化的发展，甚至诱发斑块出血和斑块，而这过程与VEGF调节血管新生有重要关联性。VEGF具有特异性促进血管内皮细胞增殖、分裂、迁移、促进新生血管形成的作用，其过程主要是通过2个在血管内皮细胞的特异性表达受体来完成的VEGFR-1和VEGFR-2生物学功能[8-10]。VEGFR-1主要表达在造盘干细胞上。而VEGFR-2 则主要表达在血管内皮细胞上。因此，VEGF所引起的内皮细胞生理或病理的改变主要是由VEGF 或VEGFR-2通路所介导。

由此可见Apo-E基因缺失可制备稳定、成功率高的MCAO大鼠模型，操作简单、创伤小、重复性好，为进一步研究缺血性脑卒中的发病机制及评估疗效提供良好的依据。