常见杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力效应

林天然 ，卢艺惠，曾文龙，林晓路，赖荣泉，汤鸣强,4，彭水连

（1福建省烟草公司龙岩市公司，福建龙岩 364000；2福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建福清 350300；3福建农林大学植保学院，福州 350003；4现代设施农业福建省高校工程研究中心，福建福清 350300；5龙岩市烟草公司长汀分公司，福建长汀 366300）

0 引言

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)感染导致的烟草青枯病是世界性重要土传病害之一。该病菌广泛分布于热带、亚热带和温带地区，防治难度大，给烟草生产带来了极大的威胁[1]。近年来，随着气候变化的加剧，烟田环境青枯病的发生也愈加频繁，发病的范围也愈加广泛[2]。国内外学者对烟草青枯病的防治开展了广泛的研究，主要方向涵盖了农业防治、抗病品种选育[3]、化学防治[4]、生物防治[5]和基因工程等方面，取得了较大的进展[6]。目前，国内化学防治仍是控制烟草青枯病的主要技术手段[7-8]。尚志强[9]采用20%青枯灵400～600 倍液、200 g/mL 农用链霉素灌根取得较好的防治效果。龚广生等[10]研究应用200 U的链霉素或者叶青双可湿性粉剂500 倍液灌根，烟草青枯病可得到有效控制。为筛选出有效防治烟草青枯病的药剂，笔者采用平板抑菌圈法测定硫酸链霉素、乙蒜素、辛菌胺醋酸盐、克菌康、青枯灵5种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力作用，并通过先接种病原后灌药处理的温室盆栽试验检测其药效。在此基础上采用不同作用机制杀菌剂复配，研究其复配增效作用，以期为烟草青枯病的高效化学防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试病原菌与烟草品种 烟草青枯病菌XQ23菌株分离自福建龙岩上杭庐丰烟田土壤，分离菌株于25%甘油中，-80℃保存。供试烟草品种为‘云烟87’，由福建省烟草公司龙岩市分公司提供。

1.1.2 培养基

（1）NA 培养基。葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母膏0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。

（2）TTC 培养基。将上述NA 培养基融化并冷却至50℃，加入TTC使其终浓度为50 mg/L。

1.1.3 供试药剂72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂，重庆丰化科技有限公司；1.8%辛菌胺醋酸盐AS，山东胜邦绿野化学有限公司；3%克菌康WP，厦门凯立生物制品有限公司；50%青枯灵可湿性粉剂，山东金山生物工程有限公司；80%乙蒜素，河南科邦化工有限公司。

1.1.4 主要仪器P402N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；GSP-9050MBE隔水式恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；AB204-E酸度计，上海雷磁仪器厂；7200型分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草幼苗培育 将‘云烟87’的包衣种子放入培养皿萌发2 天，然后将幼苗移栽于装有草炭和蛭石的塑料盆内，每盆4株，置于温度为28～32℃温室内培育，幼苗生长45天后备用。

1.2.2 供试药剂对烟草青枯病菌EC50的测定与比较 取1 mL 经活化的青枯病菌悬液（浓度108cfu/mL）于平皿，倒入NA 琼脂培养基混和均匀并凝固。将蘸有供试药液的圆形滤纸片等距放置于平板上（表1），每处理3 个重复，以无菌水为对照。将平板置28℃恒温培养36 h，用十字交叉法测量抑菌圈直径，根据农药室内生物测定数据处理系统软件计算5种杀菌剂对烟草青枯病病菌的抑制中浓度EC50和相关系数r，通过EC50值比较供试杀菌剂对烟草青枯病菌的抑菌效果[11]。

1.2.3 不同杀菌剂复配的联合毒力测定 根据各杀菌剂单剂的毒力测定结果，选取效果较好且杀菌机理不同的青枯灵与农用硫酸链霉素进行复配。以青枯灵为标准药剂将2 种杀菌剂按照1:1、1:3、3:1 的体积比混合配制成复配剂，按照1.2.2的方法测定复配剂对烟草青枯病菌的抑菌效果，并采用孙云沛（1960）方法计算共毒系数(CTC)[12]。若CTC≥120 表示增效作用；CTC≤80，表示拮抗作用；80＜CTC＜120，表示相加作用。

表1 供试药剂的浓度梯度 mg/L

1.2.4 5 种杀菌剂的盆栽药效试验 将6 叶烟苗移栽于花盆中并缓苗1 周，在烟株根部周围划入土壤中使烟株一部分支根断掉，将配制好的青枯病菌菌悬液（浓度1×108cfu/mL）从划入的部位灌入，每盆烟苗30 mL，再等量灌入72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂1500倍液、50%青枯灵400 倍液、80%乙蒜素200 倍液、1.8%辛菌胺醋酸盐100 倍液和3%克菌康800 倍液杀菌剂，以等量清水处理作为空白对照。将施药后的花盆置人工气候箱中培养（温度(28±1)℃，相对湿度95%）。盆栽试验施药1 次，每个处理设3 组重复，每组重复10 株烟苗。定义施药当天为施药0天，每隔7天进行一次染病情况调查。施药28 天后按照式(5)～(7)计算青枯病的发病率及病情指数[13]。

1.2.5 调查统计 于2016 年7 月10 日调查防治效果。小区调查采用全面普查法进行，按各分级标准记载各小区的发病情况，统计病情级数，计算病株率、病情指数和防治效果。烟草病情分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准YC/T 39—1996《烟草病害分级及调查方法》进行[14]。

1.2.6 数据处理与分析 用Excel 2003 和SPSS 15.0 软件对数据进行单因素方差分析，各处理间的显著差异采用单因素方差分析(ANOVA)评价，平均值多重比较采用最小显著极差法，显著水平为0.05，数据用平均值±标准差表示[15]。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂对烟草青枯病菌的室内毒力

EC50是各杀菌剂毒力大小的重要衡量指标之一，毒力越大则EC50越小。试验结果（表2）表明，5种杀菌剂对烟草青枯病菌的室内毒力由大到小为青枯灵＞农用硫酸链霉素＞辛菌胺醋酸盐＞克菌康＞乙蒜素。毒力回归方程斜率是病菌对药剂剂量变化的反应速率，可以看出在各杀菌剂的不同稀释倍数下，烟草青枯病菌对青枯灵和农用硫酸链霉素有较高的敏感性。实践中要将药剂对病原菌的EC50值和毒力回归方程的斜率结合，才能比较科学地评价各杀菌剂的室内毒力测试结果。

2.2 杀菌剂复配对烟草青枯病菌的毒力

根据单剂毒力的测定结果，选取青枯灵与农用硫酸链霉素进行复配，考察2 种杀菌剂不同体积比复配下对烟草青枯病菌的毒力效应，研究其协同增效作用。试验结果（表3）表明，青枯灵与农用硫酸链霉素的复配体积比为1:1 和3:1 情况下，共毒系数分别为43.89和28.15，均远小于100，为拮抗作用；而青枯灵与农用硫酸链霉素的复配体积比为1:3 时，共毒系数为148.48，其值大于100，表现为增效作用。

表2 不同杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力测定结果

2.3 不同杀菌剂对烟草青枯病的温室盆栽试验

由图1可知，供试的5种杀菌剂对烟草青枯病都有一定的防治效果，而且均能够拖延青枯病的发病时间。从3 次用药调查结果看，50%青枯灵处理能够显著降低烟草青枯病的发病率，其防效达(88.6±3.91)%，其次是农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐处理，防效分别为(56.7±5.42)%、(75.6±1.98)%。5 种杀菌剂中防效较差的是克菌康和乙蒜素，两者的防效相当，没有显著性差异。

3 结论与讨论

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)寄主范围广泛，可侵染54科450多种植物[16]。有研究表明，该菌的初次侵染以作物根际土壤为主，带菌土壤是青枯病的主要病源，预防青枯菌的侵入是青枯病防治的关键[17]。目前，对烟草青枯病的防控主要集中在抗病育种、农业防治、化学防控和生物防治等方面。化学防控可以推迟发病高峰期、降低危害，最大限度地降低烟叶生产的经济损失，但对烟草青枯病防控的有效药剂十分缺乏，因此筛选有效的药剂防治并进行毒力测定是一项重要内容。

化学药剂的处理方式包括喷雾、灌根和浸种等方式，实践上为更好地模拟烟草青枯病菌在土壤中的自然分布状态以及对烟苗的自然侵染方式，多采用蘸根法（灌根法）进行烟草青枯病菌的接种[18]。何永宏等[19]研究发现，烟草青枯病菌对‘云烟87’的侵染阈值为3×102cfu/mL。为提高致病效果，本试验采用的接菌浓度为1×108cfu/mL，以避免因土壤吸附对病菌侵染阈值的影响。

杀菌剂对病原菌的EC50值常是衡量杀菌剂对病原菌抑制作用的重要指标，可为药剂进行田间或保护地的实际药效试验提供参考。EC50值越小，说明供试药剂对病菌的抑制效果越好，在实际应用中对病菌的防治效果可能就越好[20]。本试验采用经典抑菌圈法研究5种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力效应。试验结果表明，72%农用硫酸链霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸盐、3%克菌康、50%青枯灵EC50分别为43.50、154.69、116.75、123.43、37.86 mg/L，对烟草青枯病菌的室内毒力由大到小为青枯灵＞农用硫酸链霉素＞辛菌胺醋酸盐＞克菌康＞乙蒜素，试验结果与黄保宏[21]、贾春燕[22]田间防治药剂筛选结果基本一致。同时也说明5种杀菌剂对烟草青枯病菌的生长均有抑制作用，而且杀菌剂浓度与抑菌效应呈现显著的正相关关系。

盆栽试验设计有药剂浸种、先灌药后接种病原和先接种病原后灌药等处理方式。本试验采用喷雾法施药，尽管5种杀菌剂的作用机理及其特性各不相同，它们对烟草青枯病都有一定的防治效果，其中以50%青枯灵和72%农用硫酸链霉素效果最佳。青枯灵是一种高效、中等毒性的有机硫杀菌剂，广泛用于农作物白叶枯病、青枯病的防治，效果良好。不少研究证实，农用硫酸链霉素是抑制多种作物病原细菌的有效药剂，也是防治青枯病菌的首选药物[21-27]，实践中通过浸种、灌根预防或者治疗等方式取得较好的防效。

化学药剂的长期频繁单一使用导致病原菌对化学农药的抗性日益提升，使得化学农药的防治效果明显降低。将不同作用机理的杀菌剂进行合理复配，不仅减少了化学药剂的使用量，降低了农户的用药成本，对环境也更加安全、友好，同时也延缓了病原菌对现有药剂抗性的产生，可谓是一举多得。本试验将青枯灵与农用硫酸链霉素按照体积比1:1、3:1 和1:3 进行复配。试验结果表明，当二者的复配体积比为1:1和3:1情况下，呈现拮抗作用；而复配体积比为1:3 时，表现为增效作用。对于复配增效作用机理的解释，研究者有不同的观点，但多数认为通过复配，一种药剂的药效作用加强了另外一种药剂对病原菌的药效作用，导致产生增效作用。由于本试验只是初步筛选，尚缺乏田间试验验证，因此其增效机制和联合作用方式等有待于深入研究和探索。