新型铂类抗癌药舒尼铂原料药中催化剂钯残留量的测定

张晓南，普冰清，陈雪江，李东娴，牛延菲，徐红贵

(1 云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2 云南白药集团创新研发中心，云南 昆明 650111；3 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)

恶性肿瘤(癌症)是严重威胁人类健康和生命安全的重大疾病，是继心血管疾病后的全球第二大死亡原因，每年导致的死亡人数超过800万人。恶性肿瘤特点之一是肿瘤细胞不受控制的快速增殖，增殖需要DNA的复制和转录，因此，DNA是抗肿瘤药物的重要靶点。铂类药物就是一类以DNA为作用靶点的无机抗癌配合物[1]。它们以被动扩散的方式和借助载铜蛋白(CTR1)的运转方式跨过细胞膜，在细胞质的水介质下进行水合反应、生成高化学活性的水合配阳离子cis-[A2Pt(II)(H2O)2]2+，扩散迁移到细胞核后，与DNA鸟嘌呤上第7位氮原子以配位键的形式结合，形成与DNA的链内交联和链间交联cis-A2Pt(II)2+/DNA，从而破坏了癌细胞DNA结构和功能，导致癌细胞的凋亡[2]。

含铂类药物的联合化疗一直是治疗胃癌的首选方案，近年来，分子靶向疗法在癌症的治疗中取得了极大的成功，但是靶向疗法的疗效因人而异，特别是胃癌，对靶向疗法不敏感，被喻为分子靶向治疗的“盲区”。同时，靶向治疗通常与化疗联用有协同抗癌效应，因此，以铂类药物为主或参与联合化疗的方案仍是临床治疗晚期胃癌和预防胃癌手术后复发的重要方法。但铂类抗癌药普遍存在肝肾毒性高，骨髓抑制毒性大，很多老年患者不能耐受，以及交叉耐用性等问题。因此，研制毒性小、对胃癌有较高疗效的新型铂类抗癌药物仍具有重要社会意义和经济价值[3-5]。

舒尼铂的研发正是以改善铂类抗癌药的肝肾毒性和骨髓抑制毒性为目的，从而达到提高患者的生活质量，延长生存期的最终目标。舒尼铂目前已完成了临床前的研发，进入临床试验申报阶段，在其合成过程中使用了含金属钯的催化剂，因此对钯催化剂残留量的控制是其质量控制中重要的一环。基于此，本文建立了舒尼铂原料药中的钯元素含量测定的方法，并进行了方法学研究[6]，以期为舒尼铂和同类的铂类抗癌药的新药研发提供可靠的数据支持。

1 仪器与试药

AG285型电子天平，瑞典METTLER TOLEDO公司；Speedwave 4微波消解系统，德国Berghof公司；7700X电感耦合等离子质谱仪，美国安捷伦公司；Advantage 10 Milli-Q超纯水发生器，美国密理博公司。

钯(Pd)标准液(批号：198016，浓度为1000 μg·mL-1)，国家有色金属及电子材料分析测试中心；内标溶液(ICP-MS Internal Std Mix，批号：5188-6525)，Agilent Technologies；硝酸(优级纯)；去离子水(超纯水)；供试品：舒尼铂原料药，由本实验室合成，批号：SNB-01。

2 方法与结果

2.1 工作条件

射频功率：1600 W；等离子体气体流量：15 L·min-1；辅助气流量：1.0 L·min-1；载气流量1.05 L·min-1；雾化器温度：2 ℃；采集模式：质谱图；峰型：3个点；积分时间：0.3～0.9 s。

2.2 内标溶液的制备

精密量取内标标准溶液适量，用5%稀释制成每1 mL各含铟元素1 μg的混合溶液，即得。

2.3 标准曲线溶液的制备

精密量取标准品液(1000 μg·mL-1)适量，用5%硝酸溶液稀释制配制成含钯1500 μg·L-1标准储备溶液。精密吸取上述配制的标准储备溶液适量，用5%硝酸稀释至刻度，制成含钯质量浓度为25、60、90、120、150 μg·L-1的标准溶液即得。以上溶液应临用新配。

2.4 供试品溶液的制备

称取样品约0.1 g，精密称定，置聚四氟乙烯消解罐内，加硝酸8 mL，混匀，盖好内盖，旋紧外盖，浸泡过夜，置微波消解仪内进行消解，消解程序见表1。待消解完全后，药液转移至50 mL量瓶中，用少量超纯水洗涤消解罐3次，合并洗液，用水稀释至刻度，摇匀，即得。消解所得溶液应无色透明，无肉眼可见异物。同法制备样品空白溶液。

表1 微波消解程序

2.5 测定方法

测定时选取的同位素为105Pd，以115In作为内标。仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样品管插入各个浓度的标准品溶液中进行测定(浓度依次递增)，以待测元素计数值与内标元素计数值的比率值(3次读数的平均值)为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

将仪器的样品管插入供试品溶液中测定，取3次读数的平均值。代入标准曲线，计算得相应的样品溶液中待测元素浓度。在同样的分析条件下进行空白试验，扣除空白干扰。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性试验

取标准溶液测定，以钯元素浓度为横坐标，钯元素计数值和对应铟元素计数值的比值为纵坐标，绘制曲线。结果表明钯元素在0～150 μg·L-1浓度范围内线性关系良好，标准曲线为：y=0.008x+0.007，r=0.999。

2.6.2 检测限与定量限测定

制备样品空白溶液平行11份，依次按“2.1”项下条件进行测定，计算11次空白溶液中钯元素浓度的标准偏差σ。3倍标准偏差除以标准曲线斜率为检出限，10倍标准偏差除以标准曲线斜率为定量限，结果钯元素检出限为0.0050 μg·L-1，定量限为0.0167 μg·L-1；按取样品0.1 g，定容至50 mL计，检出限为0.0025 μg·g-1，定量限为0.0084 μg·g-1，可以满足检测要求。

2.6.3 回收率试验

称取供试品6份，每份约0.1 g，精密称定(批号：SNB-01已测得含Pd 2.21 μg·g-1)，加入约和样品原含量相等量的钯元素标准品0.2 μg，然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，计算回收率，由结果可知，回收率为96.79%～112.98%，RSD为8.60%(n=6)，符合规定[6]。

2.6.4 重复性试验

称取同一批号(批号：SNB-01)的样品6份，精密称定，消解定容后按“2.1”项下条件测定。计算得钯平均含量为2.21 μg·g-1，RSD为2.40%(n=6)，结果表明本法具有良好的重复性。

2.6.5 耐用性试验

精密称取同一批号(批号：SNB-01)的样品6份，其中2份于测定前2天消解，密封后冷藏保存；2份于测定前1天消解，密封后冷藏保存；另外2份测定当天消解，6份样品于同一天按“2.1”项下条件测定，观察钯元素稳定性，计算得钯平均含量为2.33 μg·g-1，RSD为4.09%，表明72小时内，钯元素在溶液中稳定性能够符合测定的要求。

2.7 样品测定结果

按“2.1”项下条件测定 3 批样品(批号：SNB-01、SNB-02、SNB-03)结果钯元素含量分别为2.21、3.61、1.78 μg·g-1。

3 结 论

《中国药典》2015年版尚未对钯残留做出限量规定，在注射剂中只是对5种重金属进行了限定：按每日最大使用量计算，铅不得超过12 μg，镉不得超过3 μg，砷不得超过6 μg，汞不得超过2 μg，铜不得超过150 μg。ICH Q3D元素杂质指南[7]规定，钯的安全风险等级为2B级，注射用制剂中钯元素的PDE标准(每日允许暴露量)为10 μg·d-1；美国药典通则 USP<232>[8]也明确规定注射用制剂中钯元素的PDE标准(每日允许暴露量)为10 μg·d-1。舒尼铂预计的最高临床用量为0.1g·d-1，因此舒尼铂原料药的钯含量最高限度应为10 μg/0.1 g=100 μg·g-1。本实验的3批舒尼铂原料药中的钯含量分别为2.21、3.61、1.78 μg·g-1，远低于这个限度，因此可以认为舒尼铂原料药生产工艺中的钯残留量控制是比较成功的。

本文采用的微波消解-电感耦合等离子体质谱法样品消耗量低，灵敏度高，操作简便，完全能满足舒尼铂原料药中钯残留量控制的要求，可作为标准方法，列入相关质量标准，同时也可为其它类似药物中的金属催化剂残留量控制提供思路。

在试验中我们还发现，铂元素在电感耦合等离子体质谱仪的进样系统中存在较为严重的记忆效应，如需检测铂含量较高的样品，建议使用专用的样品管、雾化器、矩管、采样锥，并在进样完成后用10%的硝酸溶液冲洗进样通道30 min以上。