香菇多糖对脓毒症大鼠模型肺水代谢的影响研究＊

巫莉萍，薛小燕，温建东

（江西省赣州市人民医院，赣州 341000）

脓毒症是烧伤、创伤、外科术后等较常见严重并发症， 是因细菌感染引起的全身性炎性反应综合征， 是一种病死率较高的难治性并发症， 据统计，脓毒症病死率在30%-50%[1]。 脓毒症易并发多脏器功能障碍综合征（MODS），其中肺损伤是最先出现、发生率最高的一个症状，是导致死亡主要原因，病死率增高至70%，是迄今临床迫切需要解决的棘手问题[2]。 临床研究表明，肺水代谢障碍是肺损伤发生机制的一个中心环节， 在肺损伤发生发展中发挥重要影响。 诸多研究发现，香菇多糖有着抗炎、抗肿瘤、改善机体免疫等作用。 但是关于香菇多糖抗炎机制尚不明确， 特别是在脓毒症中对肺损伤的肺水代谢的影响研究不多。 本研究分析香菇多糖对脓毒症大鼠模型肺水代谢的影响，以便进一步明确香菇多糖的抗炎作用机制， 现如下报告。

1 材料和方法

1.1 实验材料 将40 只健康雄性大鼠 （由赣南医学院实验动物中心提供）纳入本课题研究中，体重170-230g，平均（200.5±10.2）g。 有关操作均严格按照“实验动物保护原则”进行，由专人饲料喂养，自由饮食，饲料和用水无污染且新鲜，饲养场所室内温度（22.0±1.0）℃，湿度（55±5）%。 DMSO 均购自西格玛公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 所有小鼠在分组前禁食过夜，但可自由饮水。 采用经典CLP 术创建脓毒症模型，所有操作均在SPF 手术间举行，均在上午进行。 腹腔注射3%戊巴比妥钠（30-50 mg/kg）麻醉，腹部皮肤应用75%乙醇彻底消毒，腹部1/4 象限皮肤内作一道3-4cm 的纵切口， 逐步打开并深入多， 暴露腹腔，找到盲肠取出外，于盲肠1/2 处应用3-0 丝线结扎盲肠（约结扎50%），于结扎盲肠中间用单针头（18G）自系膜侧指往系膜对侧贯穿性穿孔，自穿孔内轻轻挤出一小点粪便到盲肠外， 再纳回盲肠，逐层缝合， 再在皮下注射0.9%生理盐水 （37℃，5 ml/100 g 体重）行液体复苏，最后放回。

1.2.2 香菇多糖制备 取干燥处理小冬菇250g，加水浸泡10min 后剪碎， 应用乙醇回流脱脂12h，然后行真空干燥。 再应用热水提取3 次，残渣用5%氢氧化钠溶液持续浸泡24h，残渣弃除，浸泡液通过36%醋酸中和，通过离心弃除沉淀，将上清液浓缩到1000ml 后加入等体95%乙醇，再静置过夜就会对离心得到沉淀物作为香菇粗多糖。该多糖溶液应用1%的双氧水脱色，脱色处理后的多糖溶液通过微滤处理后， 应用500kDa 超滤膜分级分离，超滤收集样品经冻干后得到精制香菇多糖。

1.2.3 分组及干预 将本研究选定的大鼠随机随机随机分成正常对照组、脓毒症模型组、香菇多糖预防组及香菇多糖治疗组，每组10 只。正常对照组每日腹腔注射0.9%生理盐水2.5ml/kg； 脓毒症模型组则每日腹腔注射蒸馏水2.5ml/kg；香菇多糖预防组在建模前腹腔注射100mg/kg 香菇多糖; 香菇多糖治疗组在建模后腹腔注射香菇多糖100mg/kg。每组均连续治疗3d。

1.2.4 检测 ⑴肺水代谢测定：在干预完成后第2d处死大鼠， 应用10%水合氯醛溶液腹腔注射，0.3ml/100g 麻醉，待麻醉后，没有意识时，采用腹腔腹主动脉采血， 使大鼠失血死亡， 然后取出心脏和肺， 应用4-8℃的0.9%生理盐水冲洗。 结扎左肺门，对右肺支气管肺泡进行灌洗，收集肺泡灌洗液5ml，然后以 2000r/min，离心 10min，取上层清液置于-70℃冻存，采用Bradford 法测定BALF、血清蛋白浓度，计算两者的比，即LPI。 ⑵病理学HE 染色及评分：取左肺放于4%的多聚甲醛中固定24h，经乙醇梯度脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋、5μm 厚切片、二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水、HE 常规染色、封片后光镜下观察肺组织病理变化。 每个标本由同一名病理医生根据肺间质水肿、肺泡水肿、炎细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成、肺不张改变，按程度无、轻、中、重，分别计 0，1，2，3 分。 另外，取部分左肺下部组织置于-70℃冰箱冻存， 以Western Blot法检测肺组织内的 AQP1、AQP5 的表达， 以 βactin 蛋白表达为参照， 采用Quantity One 图像系统扫描、分析，以光密度比值表示。 应用滤纸吸干剩余左肺下叶组织的水分， 然后应用分析天平精确称湿重(w)，再置入80℃烤箱内连续烘烤48h 后，再称干重(D)，计算肺 W/D[3]。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0 软件包完成本课题研究的统计学处理，呈正态分别计量指标用（）表示，多组间以t 检验；计数指标则用例数（%）表示， 组间以 χ2检验，P＜0.05 表示存在统计学意义。

2 结果

2.1 四组肺组织病理变化 通过HE 染色显示，正常对照组大鼠的肺泡、肺泡管、肺泡隔、支气管上皮等形态均完整，肺泡壁厚度正常，管腔内无炎性细胞和分泌物； 脓毒症模型组大鼠肺泡壁弥漫性增厚，肺泡壁血管充血，部分肺泡实变，腔内大量炎性渗出物，支气管周围组织弥漫性增生；香菇多糖预防组大鼠肺泡壁轻度增厚，少量肺泡隔断裂，中度炎性细胞渗出； 香菇多糖治疗组病变显著减轻，肺组织形态相对完整，少量炎性细胞渗出，如图1。从病理学看，脓毒症模型评分最高，其次是香菇多糖预防组，均高于正常对照组、香菇多糖治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），如表 1。

图1 大鼠肺组织病理变化

表1 不同组大鼠肺组织病理学评分对比（，分）

表1 不同组大鼠肺组织病理学评分对比（，分）

组别 数量 病理学评分正常对照组脓毒症模型组香菇多糖预防组香菇多糖治疗组10 10 10 10 0 F P 14.76±1.33 7.18±1.18 3.52±0.40 5.188 0.001

2.2 不同组肺水代谢指标水平对比 通过测定，香菇多糖高治疗组、 香菇多糖干预组及脓毒症模型组的 AQP1、AQP5 均低于对照组,而 LPI、W/D 均显著高于对照组（P＜0.05），且香菇多糖高治疗组各指标水平均优于香菇多糖干预组（P＜0.05），如表2。

表2 不同组大鼠模型肺水代谢指标水平比较（）

表2 不同组大鼠模型肺水代谢指标水平比较（）

组别 数量 AQP1 AQP5正常对照组脓毒症模型组香菇多糖预防组香菇多糖治疗组10 10 10 10 t P 1.04±0.18 0.32±0.10 0.57±0.23 0.83±0.36 10.283 0.001 0.56±0.10 0.19±0.05 0.30±0.08 0.42±0.04 15.036 0.000 LPI 1.44±0.40 5.43±1.60 3.15±1.43 1.92±0.80 17.017 0.000 W/D 4.22±0.86 8.05±1.33 6.55±1.24 4.97±1.30 14.724 0.001

2.3 各组大鼠 AQP1、AQP5 表达 Western Blot 法检测显示，正常组AQP1、AQP5 表达最高，其次是香菇多糖治疗组，再次是香菇多糖预防组，脓毒症模型组最低（P＜0.05），如图 2。

3 讨论

图2

脓毒症发病早期表现为全身性能高炎性反应综合征，机体产生过度氧化应激与大量炎性因子，并随多脏器功能损伤，肺脏是最为直接、最容易受到损伤的脏器。 在大量炎性细胞浸润到肺组织，促炎因子大量释放，对内皮细胞造成直接性损伤，使血管通透性增高，引起肺水肿和呼吸困难，严重威胁到患者生命安全。

水通道蛋白(AQPs)是一种能介导自由水跨膜转运的同源蛋白家族总称， 在人的呼吸系统中主要有 AQP1、AQP3、AQP4 及 AQP5 等四种表达。 其中，AQP1、AQP5 和肺损伤密切相关， 是反映肺水肿重要指标。 AQP1 分布在气道周围的毛细血管、淋巴管以及肺泡毛细血管的内皮细胞中， 功能就是负责清除支气管与脉管周围组织中的水分；AQP5 存在于肺泡I 型上皮细胞和气道分泌上皮细胞，功能就是清除肺泡腔内水分。 临床研究发现，和野生型比较，AQP1 基因敲除小鼠的肺泡毛细血管间水渗透性、 通透性降低10 多倍；AQP1、AQP5都敲除小鼠则降低25-30 倍，发生严重肺水肿。 可以看出，AQP1、AQP5 特异性转运水分子， 能有效维持血管和间质间的水平衡[4,5]。肺损伤的脓毒症一个严重并发症，其病理主要是肺泡-毛细血管急性损伤，引起通透性增高，肺间质渗出、水肿，肺通气和血流比失调，炎性细胞浸润等，肺部影像学表现出非均一性渗出性病变。 临床研究发现[6]，AQP1、AQP5 在肺损伤后肺内液体平衡调控中发挥重要作用，直接参与到肺水肿发生。

香菇多糖是一种自食物香菇内提取出的物质，有着抗肿瘤、调节机体免疫、抗菌、抗氧化等多种生物学活性，其作为T 细胞免疫强化剂，可激活NK 细胞、 中性粒细胞以及巨噬细胞等免疫细胞[7,8]。 本研究结果显示，香菇多糖高治疗组、香菇多糖干预组及脓毒症模型组的AQP1、AQP5 均显著低于对照组， 而 LPI、W/D 均显著高于对照组 （P＜0.05），且香菇多糖高治疗组各指标水平均优于香菇多糖干预组（P＜0.05）。 应用香菇多糖干预后，上述变化具显著改善，LPI、W/D 降低，AQP1、AQP5 表达增高，与相关课题研究报道基本一致[9,10]。 由此提示香菇多糖可能通过上调AQP1、AQP5 表达，改善大鼠肺水代谢， 减轻肺水肿， 进而有效减小肺损伤，保护肺脏。

综上而言， 香菇多糖能有效改善脓毒症引起的肺水代谢，有助于预防肺损伤，促进病情转归，具有重要的临床治疗价值。