固体碳源生物膜处理地下水硝酸盐污染的脱氮性能研究*

张立秋 雷志娟 李淑更 黄凤丹 邵 兵 朱晓辉

(1.广州大学土木工程学院，广东 广州 510006；2.珠江三角洲水质安全与保护教育部重点实验室，广东 广州 510006；3.广州大学环境科学与工程学院，广东 广州 510006)

面对淡水资源短缺现状，优质地下水成为重要饮水水源之一。但工业“三废”乱排，农业生产过量施肥及生活污水、实验室废水、医院污水等排放导致地下水硝酸盐污染[1-2]。近30年来，污染问题并未得到有效解决，对人体健康存在严重危害，还存在水环境富营养化等威胁。据《2018年中国生态环境状况公报》显示，2018年全国10 168个地下水监测点中，水质为较差和极差级监测点占86.2%，其中超标指标包括“三氮”，表明我国大面积的地下水硝酸盐污染成为亟待解决的问题[3]。

目前，常见的水体硝酸盐去除技术是物理化学和生物处理技术，由于生物处理技术高效低耗，生物反硝化脱氮使用更广泛[4]。生物反硝化的重要影响因素是有机碳源，往往地下水中有机碳含量都较低，过程中需要投加有机碳为反硝化提供能量。目前，有机碳源包括液体和固体碳源。常用的液体碳源如甲醇、乙醇等在运行中存在投加量控制难、成本高、运行复杂等问题。作用于固相反硝化中的固体碳源可克服液体碳源造成的风险并提供碳源和生物膜载体[5]。目前，固体碳源可分为天然材料和人工合成的可生物降解聚合物(BDPs)。天然材料取材便捷、成本较低但成分复杂，且释碳持续时间短。而BDPs供碳能力强，浸出物不影响出水水质[6]。因此，在生物反硝化脱氮过程中BDPs类固体碳源研究更值得关注。研究表明，聚己内酯(PCL)、聚-β-羟丁酸、聚丁二酸丁二醇酯、聚羟基戊酸酯和聚乳酸等应用于固相反硝化处理硝酸盐污水都具有良好的脱氮效能[7-9]。由于处理水质的情况不一，碳源种类和系统工艺选择是一直以来研究的方向，而系统运行条件决定着工艺能否发挥最佳处理效果。罗国芝等[10]578利用PCL作为碳源处理水产养殖水，固定床生物反应器在水力停留时间(HRT)为6 h时，硝酸盐氮的处理效果最好。LI等[11]研究三级脱氮技术处理污水处理厂二级出水，结果表明，以PCL为滤料的生物滤池具有良好的脱氮效能且在低温下仍有一定反硝化能力。材料填充过少导致水中微生物可利用有机物量偏少从而引起不完全反硝化，脱氮性能差，同时增加温室气体排放量；反之则浪费资源，也会导致出水中有机物浓度过高而造成二次污染。目前，相关研究局限于使用外加碳源生物膜反应器载体填料的选择[12-14]，探究PCL填充率并结合HRT因素提高脱氮性能方面鲜有报道。

本研究采用PCL为碳源和生物膜载体，研究填充率和HRT对生物膜反应器脱氮的影响，通过分析反应器的脱氮性能及微生物群落结构等，优化反应器运行性能，为建立长久高效的硝酸盐污染地下水生物修复技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PCL外购，是直径2～3 mm的白色椭圆形颗粒，平均分子量约80 000，表面光滑，但具有良好的生物降解性，经微生物降解后表面会变粗糙。

实验进水由硝酸钾、磷酸二氢钾配制，保持氮磷质量比为20∶1，模拟硝酸盐污染地下水；添加氯化钙和无水硫酸镁供微生物生长。

实验接种污泥取自广州市某污水处理厂二沉池。

1.2 实验装置

采用有机玻璃组成上流式生物膜反应器，由蠕动泵控制进水，装置示意图见图1。柱内直径7 cm，柱高50 cm。

1.3 实验方法

将填料与砂砾洗净填于3个完全相同的反应器中使得其填充率(体积分数)分别为20%、40%、60%，编号为反应器1～3，采用快速挂膜法进行挂膜启动，将进水与接种污泥按照体积比1∶1混合均匀，加入反应器搅拌，使接种污泥与填料充分接触，静置24 h后，保持2.5 mL/min流速开始连续进水，进行反硝化微生物驯化，每天测定出水的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮、COD浓度。当连续3 d出水的硝酸盐氮质量浓度相对误差在5%内，认为反应器稳定运行，驯化结束。然后以3.5 mL/min流速继续运行。实验进程分3个阶段，依次保持进水硝酸盐氮分别约为80、160、120 mg/L，各运行一段时间观察脱氮效果。计算PCL的损耗率。实验最后一天分别取3个反应器中附着在PCL上的生物膜进行高通量测序，对应编号为C1～C3。

1—进水桶；2—蠕动泵；3—进水口；4—砂砾；5—填料；6—取样口；7—出水口；8—出水桶图1 实验装置示意图Fig.1 Experimental equipment

以最优填充率填充5个反应器，保持HRT分别为22、16、10、4、2 h挂膜，编号为反应器A、B、C、D、E。

1.4 化学分析

水样经过0.45 μm定性滤纸过滤，硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮按照文献[15]进行检测，总有机碳(TOC)使用岛津TOC-L系列TOC分析仪测定。

1.5 扫描电镜观察

反应运行结束后，取表面生物膜成熟的PCL颗粒，经自来水冲洗后，使用超声波清洗仪(SB-5200DTD)清洗颗粒，晾干后使用扫描电镜(日本电子JSM-7001F)进行扫描。

1.6 微生物多样性分析

1.6.1 DNA提取与检测

实验采用PowerSoil DNA Isolution Kit试剂盒(MoSio公司，美国)提取生物膜中的DNA，并严格按照试剂盒说明进行操作。

1.6.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增

利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR应加入的DNA量。PCR所用的引物已融合了Miseq测序平台V3～V4通用引物(341F引物和805R引物)。采用梯度PCR方法，得出不同退火温度下扩增的结果，选取最佳条件进行扩增。

1.6.3 生物群落结构分析说明

采用16S rRNA分类法对97%相似水平的操作分类单元(OTU)代表序列开展分类学分析，进行物种注释，并统计群落组成。

2 结果与分析

2.1 填充率对系统脱氮的影响

由图2和图3可见，随着填充率的增加，出水硝酸盐氮浓度降低，总阶段去除率增加。第1阶段时，反应器1、2在前4天波动较大，之后3个反应器硝酸盐氮去除率为97%，差别不大。第2阶段时，反应器1脱氮效果逐渐变差，出水硝酸盐氮浓度最高达59.48 mg/L，分析原因认为，进水氮负荷提高后系统通过微生物分解的有机物不足以完成完全反硝化，造成出水中硝酸盐氮含量不断增加；反应器2前期出水硝酸盐氮浓度有轻微波动，这是因为系统中生物量一定，进水氮负荷增加后，微生物的增长速度未能赶上增加的硝酸盐氮含量[16]。第3阶段时，反应器1、2的脱氮效果先变好后变差，反应器1的出水硝酸盐氮降低至小于1 mg/L后立马反弹，逐渐上升至33 mg/L左右；反应器2在出水硝酸盐氮降低至小于1 mg/L后保持低质量浓度5 d后才上升，且保持在14 mg/L左右，可知反应器2脱氮效果恢复更快。反应器2、3硝酸盐氮总阶段去除率分别为94%和96%。在填充率增加20百分点的情况下，硝酸盐氮总阶段去除率仅增加2百分点，造成资源浪费。

图2 填充率对硝酸盐氮质量浓度的影响Fig.2 Effect of filling rate on mass concentration of nitrate nitrogen

图3 填充率对硝酸盐氮去除率的影响Fig.3 Effect of filling rate on nitrate nitrogen removal rate

反应器1的填充率最少，可降解碳总量不足，生物膜载体面积减少，生物量不足，系统不稳定，材料降解利用效果也会变差，且填充高度10 cm，氮污染物和释放的碳源未与微生物充分接触反应即被排出[17]。反应器3填充率最大，释碳量大。在高碳氮比环境下，碳源可供其他微生物使用，如参与硝酸盐异化还原成铵(DNRA)过程的DNRA菌会与反硝化菌形成竞争关系产生氨氮而降低总氮去除率[18-19]。因此，40%的填充率较合适。

由图4可见，3个反应器的TOC均随时间延长而呈逐渐波动下降趋势。第1阶段时，TOC突然增加至70 mg/L左右，表明参与PCL生物降解的微生物适应环境进行大量生长。当出水TOC浓度处于稳定状态时，说明微生物降解释碳与微生物反硝化耗碳处于动态平衡[20]。第2阶段时，反应器2、3释碳量均有明显提高，TOC增加量接近25 mg/L，反应器1不断下降并稳定在10 mg/L左右。因为高分子聚合物的降解和反硝化脱氮是两个相互独立的过程，系统中氮负荷的改变，打破之前有机物产生和利用的平衡[21-22]。第3阶段时，反应器1、2、3的TOC分别稳定在10、20、30 mg/L左右，说明反应器3释碳持续能力较好，但TOC浓度偏高。

图4 填充率对TOC的影响Fig.4 Effect of filling rate on TOC

2.2 HRT对系统脱氮的影响

由图5、图6可见，HRT对系统脱氮有明显的影响。当HRT为22、16、10 h时，出水硝酸盐氮普遍低于1 mg/L，去除率都高于95%。降低HRT到4 h，系统运行68 d后出水硝酸盐氮浓度明显上升，去除率降为88%，出水硝酸盐氮质量浓度平均值为8.80 mg/L。当HRT为2 h时，系统保持良好脱氮效果30 d，出水硝酸盐氮逐渐上升到40 mg/L左右并保持20 d，之后完全失去脱氮能力，去除率仅有58%。由表1可知，缩短HRT提升反应器容积负荷，其容积去除负荷也不断增加。当HRT为22、16、10、4 h时，HRT同样减少6 h，容积负荷增加量去除率都能达到80%；当HRT为2 h时，HRT减少了2 h，容积负荷增加量去除率仅27%，说明在该条件下反应器脱氮效能提升力在HRT为2～4 h时快速降低。

图5 HRT对硝酸盐氮质量浓度的影响Fig.5 Effect of HRT on mass concentration of nitrate nitrogen

图6 HRT对硝酸盐氮去除率的影响Fig.6 Effect of HRT on nitrate nitrogen removal rate

HRT过长，系统进行完全反硝化，脱氮效能提升却不大；HRT过短，进水与反应器填料接触时间也逐渐减少，水中硝酸盐还未与微生物充分反应便流出，且水流速度增大，使得生物膜更易脱落，生物量变少从而降低脱氮效能[23]。故HRT为4～10 h都是较合理的选择。

如图7所示，随着时间延长，出水TOC总体先增加后降低。反应器A、B、C的出水TOC平均值都较高，分别为37.12、32.61、40.03 mg/L。这是由于初始填料堆积状态不同，反应器孔隙率变化，导致挂膜效果不同，反应器C挂膜均匀，微生物与填料接触面积增加，有利于分解更多有机物释碳。反应器D、F中，出水TOC平均值分别为20.51、12.75 mg/L。HRT减少，进水氮负荷相应增大，反硝化过程所需碳源量也增大，出水TOC降低。考虑系统运行长久性与可行性，4 h为最佳HRT。

2.3 PCL的表面结构观察及损耗率

由图8(a)可观察到，使用前PCL颗粒的表面光滑，呈半椭圆状；由图8(b)可观察到，使用后PCL颗粒的表面变得十分粗糙，呈大小不同的坑洞；由图8(c)可观察到，使用后PCL颗粒呈鳞状且表面有丝状菌、杆菌附着。说明PCL在反应过程中既是生物膜的载体也是生物脱氮的碳源。

经称量和计算，填充率20%、40%、60%的PCL损耗率分别为9%、12%、2%。由此可知，填充率为40%时反应器的利用率较高。

2.4 微生物群落分布特征

如图9所示，3个样品生物膜的菌群相对丰度前四的菌门依次是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和厚壁菌门(Firmicutes)。其中，变形菌门和拟杆菌门被广泛认为是反硝化细菌的主要菌门[24-25]，以有机物为营养来源，通过分解碳源方式完成反硝化作用，是脱氮系统中微生物的重要组成部分[26-27]。C1、C2、C3中以上两菌门相对丰度总和分别达到86%、96%、80%，C2中反硝化菌门的相对丰度最高且为系统最主要菌门。

表1 HRT对硝酸盐氮容积负荷的影响

图7 HRT对TOC的影响 Fig.7 Effect of HRT on TOC

图8 PCL颗粒表面扫描电镜图Fig.8 SEM images of PCL granule surface

图9 生物膜样品中相对丰度为前四的菌门Fig.9 Microflora with relative abundance ranked top four in biofilm samples

如图10所示，主要菌属为丛毛单胞菌属(Comamonas)、热单胞菌属(Thermomonas)、固氮螺菌属(Azospira)和长绳菌属(Longilinea)，C1中相对丰度分别为46%、5%、1%、1%，C2中则分别为56%、11%、2%、1%，C3中则分别为32%、1%、1%、8%。丛毛单胞菌属为系统优势菌属，C2中相对丰度明显高于C1、C3。丛毛单胞、热单胞、固氮螺菌属均属于变形菌门，在系统中都发挥着反硝化功能。其中，丛毛单胞和固氮螺菌属既能进行反硝化作用，又能降解高分子聚合物[10]578。以上两菌属在各样本的相对丰度均为C2>C1>C3。微生物群落结构随系统运行环境改变[28]。因此，反应器2环境最适宜反硝化功能菌大量生长，主要菌属相对丰度总和最高(70%)。长绳菌属的功能是代谢多种大分子碳水化合物，分解结构顽固化合物[29]。吉芳英等[30]表示，厌氧微生物的存在可能对系统中溶解性的多聚体进行发酵，使大分子有机物转化为小分子乙酸，更易被反硝化细菌利用。

图10 生物膜样品中相对丰度≥1%的菌属Fig.10 Species with relative abundance ≥1% in biofilm samples

3 结 论

(1) 40%的填充率较合适，4 h为最佳HRT。此时反应器硝酸盐氮去除率为88%，出水硝酸盐氮质量浓度平均值为8.80 mg/L。

(2) 丛毛单胞菌属、热单胞菌属、固氮螺菌属和长绳菌属为反应器的主要菌属，且反应器2相对丰度总和最高(70%)。