甘草甜素对周围神经损伤模型大鼠神经再生的干预效果及其可能机制

郭艳峰 周 涛 戴巧英 潘乐坤 刘吉祥

(河北省邯郸市第一医院神经外科，邯郸市 056002，电子邮箱：gyf8265@163.com)

周围神经损伤是由各种原因导致的周围神经支配区域发生的运动、营养、感知障碍等，可对患者的身体健康造成严重的威胁[1-2]。周围神经损伤包括多种类型，如牵拉损伤、缺血性损伤、压迫性损伤以及其他医源性损伤等。流行病学调查数据显示，随着机动车辆逐渐普及，交通事故频发，周围神经损伤发生率逐年上升[3]。寻找一种安全有效的治疗措施对周围神经损伤患者的康复具有重要意义。中药是一种多成分复合物，有助于神经的修复和再生[4]。甘草甜素是甘草的主要活性物质，具有抗氧化、清除自由基、抗炎以及调节免疫等诸多药理作用，其抗炎作用对缺血性损伤造成的中枢神经损伤具有一定的改善作用[5-6]。目前国内外有关甘草甜素对周围神经保护作用的研究较少。本研究通过建立周围神经损伤大鼠模型，探究甘草甜素对周围神经损伤模型大鼠神经再生的促进作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取50只SD健康雄性大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供(动物许可证号：SCXK桂2014-0001)，月龄3～5(3.9±0.6)个月，体重200～251(230.5±9.8)g。所有大鼠均饲养于干净笼子，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，饮纯净水，适应性饲养1周。本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 甘草甜素购自西安拉维亚生物科技有限公司(批号：H20150801)溶液配置：将50 mg甘草甜素粉末溶于1 mL无水乙醇中，制备50 mg/mL的一级储存液备用，取10 μL 一级储存液与990 μL磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)混合制备成500 μg/mL的二级储存液备用。PBS、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)缓冲液、TBST液购自上海国药集团化学试剂有限公司(批号：H20180201、H20180402、H20180901)。生长相关蛋白43(growth associated protein 43,GAP-43)抗体和神经营养因子受体p75(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)抗体购自上海江莱生物科技有限公司(批号：H20170801、H20180302)；噻唑蓝购自南京探求生物技术有限公司(批号：TQSJ031)、二甲基亚砜购自上海艾锐化工有限公司(批号：H20180701)；IP细胞裂解液购自南京生航生物技术有限公司(批号：20150301)。

1.3 主要仪器 台式离心机(Sigma公司，型号：1-13)；倒置荧光显微镜(Nikon公司，型号：108)；酶标仪(Bio-Rad公司，型号：680)；CO2细胞培养箱(上海润度生物科技有限公司，型号：Herocell 180)。

1.4 方法

1.4.1 分组、建模及干预：(1)分组。将大鼠按完全随机数字表法分为正常对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，各10只。(2)正常对照组大鼠不做处理，其余4组大鼠建立周围神经损伤大鼠模型。采用40 mg/kg 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，取仰卧位固定，消毒后在大鼠右臀做一2 cm左右切口，将肌肉逐层分离，暴露大鼠坐骨神经，并于大鼠坐骨结节下0.5 cm的位置将坐骨神经干完全切断，行解剖对位后使用无损伤缝线将两断端神经吻合，并逐层缝合创口。(3)干预。建模后第3天开始，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别给予10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg甘草甜素溶液2 mL灌胃，1次/d，正常对照组、模型组大鼠给予等体积生理盐水进行灌胃处理。各组大鼠均连续用药干预15 d。

1.4.2 GAP-43和p75NTR蛋白表达水平的检测：干预15 d后，称重大鼠，采用40 mg/kg 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，断头法处死，于脊柱后方中间部位做一切口，将椎管完全咬开，完好无损的暴露脊髓，切取部分损伤侧脊髓，立即置于液氮速冻待检。使用PBS清洗标本3次，弃掉缓冲液后加入IP细胞裂解液裂解0.5 h，获取蛋白并测定其浓度。以20 μg/孔蛋白质上样，于SDS-PAGE缓冲液中电泳10 min，在10%的牛奶中进行电转膜，摇床上常温封闭1.5 h；37℃孵育一抗(均1 ∶500)过夜，次日使用TBST液清洗3次，10 min/次，常温孵育二抗(1 ∶1 000)1 h，TBST液清洗3次，10 min/次，加入显影剂显色，使用凝胶成像分析系统对GAP-43、p75NTR条带灰度值进行分析，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参蛋白，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值=目的蛋白相对表达量。

1.4.3 细胞增殖能力检测：以40 μg/mL脂多糖诱导B淋巴细胞增殖，以5 μg/mL刀豆球蛋白A诱导T淋巴细胞增殖。于无菌操作台上取各组大鼠脾组织，于液氮中速冻后，用甲醛浸泡固定，然后进行组织切片，置入含有RPMI 1640培养液的培养皿中使用机械-酶消化法制成单细胞悬液，并使用RPMI 1640培养液将细胞浓度调整为1×107个/mL。37℃、5% CO2环境下分别培养24 h、48 h、72 h，将培养后的细胞制成细胞悬液，接种于96孔的培养板中，每孔加入细胞悬液90 μL，各组细胞均加入10 μL的培养液，每组设置5个复孔，将细胞置于37℃ 、5% CO2细胞培养箱内培养。分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL噻唑蓝继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡10 s，采用酶标仪测定于570 nm波长处读取细胞OD值，计算细胞增殖率，增殖率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4.4 神经元细胞凋亡检测：取大鼠损伤脊髓，提取神经元细胞，将各组细胞转至6孔板，在37℃、5% CO2下培养24 h、48 h、72 h，0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min离心5 min，收取细胞，PBS重复洗涤2次，2 000 r/min离心5 min，收集细胞，加入1 mL 碘化丙啶染液，常温避光放置1 h后，于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.4.5 比目鱼肌肌肉指数及有髓神经纤维直径、数量的测定：完全暴露各组大鼠损伤侧后肢三头肌，向上分离并于跟腱止点位置将三头肌切断，沿比目鱼肌向下分离三头肌，同时切取比目鱼肌，切除结缔组织后去除表面血液，称取重量，计算比目鱼肌肌肉指数，比目鱼肌肌肉指数=比目鱼肌重量/大鼠麻醉处死时体重×100%。取大鼠神经远端0.6～0.7 cm坐骨神经干组织，液氮冷冻后用甲醛浸泡固定，制作组织切片后进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，400倍视野下照相，使用Image-ProPlus 6.0软件统计单位面积内的髓神经纤维直径、数量。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS 21.0统计软件进行分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结 果

2.1 各组大鼠脊髓组织GAP-43、p75NTR蛋白相对表达水平比较 模型组，低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组大鼠GAP-43蛋白相对表达水平依次升高，p75NTR蛋白相对表达水平依次降低(均P<0.05)。见表1及图1。

表1 4组大鼠脊髓组织GAP-43、p75NTR蛋白相对表达水平比较(x±s)

图1 5组大鼠GAP-43、p75NTR蛋白表达水平

2.2 各组大鼠T、B淋巴细胞增殖情况比较 各个时间点，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组大鼠T、B淋巴细胞增殖率均依次降低(均P<0.05)，见表2。

表2 4组大鼠T、B淋巴细胞增殖情况比较(x±s，%)

2.3 各组大鼠神经元细胞凋亡情况比较 各个时间点，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组大鼠神经元细胞凋亡率依次降低(均P<0.05)，见表3。

表3 4组大鼠神经元细胞凋亡情况比较(x±s，%)

2.4 各组大鼠比目鱼肌肌肉指数及有髓神经纤维直径、数量比较 模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组大鼠比目鱼肌肌肉指数及有髓神经纤维直径、数量均依次增加(均P<0.05)，见表4。

表4 4组大鼠比目鱼肌肌肉指数及有髓神经纤维直径、数量比较(x±s)

3 讨 论

手术治疗和药物治疗是目前临床治疗周围神经损伤常用的方法，其中药物治疗在周围神经重建中发挥着重要的作用[7]。但目前临床上治疗周围神经损伤的常用药物都有一定的不良反应，寻找一种对机体毒副作用较小的新药物具有重要意义。甘草甜素具有抗炎、调节免疫、抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤等药理作用，同时对神经损伤具有一定的保护、修复作用[8-9]。本研究显示，各剂量甘草甜素干预组大鼠比目鱼肌肌肉指数及有髓神经纤维直径、数量高于或多于模型组，提示甘草甜素能够减轻神经支配肌肉的萎缩，增加有髓神经纤维数量，促进神经再生，从而减轻神经继发性损伤。

GAP-43是一种神经组织特异性蛋白，主要位于生长锥突触中[10-11]，分布于机体脑组织、海马区、脊髓以及自主神经系统[12]。有研究显示，GAP-43表达的变化与神经元的生长发育密切相关，神经元组织生长发育过程伴随着GAP-43表达的升高，发育停止后GAP-43的表达会随之下降[13]。还有研究表明，GAP-43在轴突再生、突触重建、神经递质释放等生物过程中发挥重要的促进作用，GAP-43高表达与轴突再生以及突触重建密切相关[14]。p75NTR属于肿瘤坏死因子受体家族，是一种跨膜糖蛋白[15]，其能够与神经蛋白结合，在神经元细胞凋亡过程中发挥重要作用[16-17]。临床研究表明，p75NTR的表达与癫痫、阿尔兹海默病等神经系统疾病的发生和发展密切相关[18]，适当调控p75NTR的表达能够改善神经细胞的存活情况，从而改善病情或缓解疾病的进展[19-20]。本研究结果显示，与模型组比较，各剂量甘草甜素干预组大鼠脊髓GAP-43蛋白表达升高，p75NTR蛋白表达下降，且神经元细胞凋亡率下降，提示甘草甜素能够调控脊髓GAP-43、p75NTR的表达而缓解神经元组织继发损伤，抑制神经细胞凋亡，进而促进周围神经损伤后神经再生，并且具有一定的浓度依赖性。

有研究显示，周围神经损伤后机体会出现一定的免疫反应，影响神经修复、再生以及功能恢复。还有研究显示，抑制机体免疫反应对神经组织的修复和再生具有一定的促进作用[21]。T、B淋巴细胞是评价机体免疫功能的较为常用指标。本研究结果显示，甘草甜素干预后，大鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖率降低，提示甘草甜素能够抑制T、B淋巴细胞增殖，减轻周围神经损伤大鼠免疫反应，并且具有一定的浓度依赖性。

综上所述，甘草甜素可减轻周围神经损伤模型大鼠比目鱼肌萎缩程度，促进神经再生，这可能与其抑制T、B淋巴细胞增殖及神经元细胞凋亡，以及调控GAP-43、p75NTR蛋白表达有关。