肝癌患者组织及血清微小RNA-24和微小RNA-629的表达水平及其临床意义▲

林 洁 黄炳臣 王 娟 黄云美 黄小英

(右江民族医学院附属医院临床病理诊断与研究中心， 广西百色市 533000，电子邮箱：310564854@qq.com)

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其病死率在所有肿瘤中排名前三[1-2]。有研究显示，肝癌发生的主要危险因素是慢性HBV感染以及慢性HCV感染[3-5]，其他常见危险因素还有酗酒、糖尿病、非酒精性脂肪肝等[6]。微小RNA(microRNA,miR)是一种高度保守的单链非编码小RNA，成熟的miR通过与多种蛋白质的结合形成RNA诱导的沉默复合体[7]。miR的调控具有网络化的特性，某一miR可以靶向调节多种基因，某种基因也可能受到多种miR的调控，而目前研究发现人类60%的基因可能都受到miR的调控[8-9]。随着对miR研究的不断深入，越来越多的证据显示miR在细胞的增殖、分化等重要生理过程中扮演着重要的角色[10]。为此，本研究分析肝癌患者组织及血清中miR-24、miR-629 的表达情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 将我院2017年2月至2018年2月收治的67例肝癌患者作为肝癌组，其中男性54例、女性13例，年龄(55.2±11.7)岁；存在血管侵犯29例；肿瘤分化程度：高分化25例，中分化23例，低分化19例。纳入标准：(1)自愿参与本研究；(2)病理诊断证实为肝细胞性肝癌；(3)入院前未进行任何形式的抗肿瘤治疗。排除标准：(1)入院时存在肝功能障碍的患者；(2)有其他种类的恶性肿瘤或血液病患者；(3)患者已知情此次研究，并已签署同意书。另选取同期在我院治疗的31例慢性乙型病毒性肝炎或者乙肝相关性肝硬化患者为乙肝组，其中男性25例、女性6例，年龄(55.0±10.9)岁。纳入标准：(1)患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[11]中关于乙肝及肝硬化的诊断标准；(2)年龄≥30岁；(3)患者已知情此次研究，并已签署同意书。排除标准：(1)有恶性肿瘤者；(2)有严重的感染性或免疫性疾病者；(3)病历资料缺失者。选择同期来我院进行体检的46例健康人员为正常对照组，其中男性37例、女性9例，年龄(55.3±11.2)岁。纳入标准：(1)年龄≥30岁者；(2)受试者知情此次研究，且已签署同意书。排除标准：(1)有沟通交流障碍者；(2)已参与其他研究者。3组一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究获我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 收集资料 收集所有研究对象的一般资料，包括年龄、性别等；收集肝癌患者血管侵犯情况以及肿瘤分化程度。

1.3 miR-24和miR-629表达水平的检测方法

1.3.1 标本的采集及处理：(1)肝癌组和乙肝组患者在入院次日，对照组在入组当日，采集研究对象清晨空腹静脉血5 mL置于无添加剂的真空试管中，并放在室温下静置30 min，使血液充分凝结。将凝结后的血液放置于低速离心机中，4℃ 2 000 r/min离心10 min后使用移液器将上清移至1.5 mL的无酶EP管中，再次4℃ 16 000 r/min离心10 min。吸取上清，用300 μL的EP管分装，储存于-80℃冰箱备用。(2)取肝癌患者癌组织及癌旁正常组织(距离癌组织边缘2 cm)，用于检测miR-629及miR-24相对表达水平。

1.3.2 特异性引物的设计及合成：根据miRBase数据库(http://www.mirbase.org)公布的miR序列，设计特异性引物。其中，miR-24上游引物为5′-ACTAATRCCTCCCTCCTT-3′，下游为5′-ATAAACTTCTRGGTGTCC-3′；miR-629上游引物为5′-CGTGGGTTTACGTTGGG-3′，下游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。内参U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-629及U6下游引物作为通用引物，引物退火温度保持在55℃～60℃。引物由北京天根生化科技有限公司合成。

1.3.3 检测步骤：CFX96型PCR仪购自美国Bio-Rad公司，总RNA快速提取试剂盒(批号：rp3201)、反转录试剂盒(批号：rp3514)以及定量PCR试剂盒(批号：rp2027)等均购自北京的百泰克生物技术公司。按照总RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒说明书的步骤，提取血清及组织标本的总RNA，然后反转录为cDNA，将合成的cDNA反应液置于-20℃保存备用。PCR反应体系共25 μL，包括PCR反应液12.5 μL、cDNA模板3 μL，上下游引物各0.25 μL，超纯水9 μL。PCR反应条件：94℃下30 s预变性，共1个循环；94℃下10 s变性，共39个循环；60℃下30 s退火，共39个循环。操作时均严格根据说明书的步骤进行检测。通过2-ΔΔCt法计算miR的相对表达量。

1.4 统计学分析 使用SPSS 21.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用秩和检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较使用χ2检验；采用Spearman秩相关系数进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌患者癌组织及癌旁正常组织miR-629及miR-24的相对表达水平对比 癌组织中的miR-629、miR-24的相对表达水平分别为2.080(0.232,7.215)、1.947(0.319,10.272)，分别高于癌旁正常肝组织的1.573(0.186,4.502)、1.341(0.275,7.933)(u=4.536、3.821，P=0.001、0.003)。

2.2 3组研究对象血清miR-24和miR-629的相对表达水平比较 正常对照组、乙肝组、肝癌组的血清miR-24、miR-629相对表达水平依次升高(均P<0.05)，见表1。

表1 3组研究对象血清miR-24、miR-629相对表达水平比较[ M(P25，P75)]

2.3 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相对表达水平与临床病理指标的相关性 血清miR-629、miR-24的相对表达水平与血管侵犯情况以及肿瘤分化程度呈正相关(均P<0.05)，见表2。

表2 肝癌患者血清miR-629、miR-24的相对表达水平与临床病理指标的相关性

3 讨 论

MiR-24是近年被发现的参与基因表达调控且广泛存在于人类组织细胞的微小RNA分子，共有两个亚簇，即miR-24-1和miR-24-2，其编码基因分别定位于人类9q22和19p13,两个亚簇具有相似的生物学活性[12-13]。而miR-629定位于15q23。研究表明，miR-24和miR-629可与相应靶基因mRNA 3′非翻译区互补结合，从而在细胞的生长与分化过程中发挥重要的调控作用，它们的表达失调与各类肿瘤的发生密切相关[14]。本研究结果显示，癌组织中的miR-629及miR-24的相对表达水平均高于正常肝组织，肝癌患者血清中miR-629及miR-24的相对表达水平均高于正常对照组(均P<0.05)，即miR-629及miR-24在肝癌组织及外周血中均表达上调，表明两者在肝癌的形成过程中发挥了一定的作用。进一步行相关性分析发现，血清miR-629、miR-24的相对表达水平均与血管侵犯情况以及肿瘤分化程度呈正相关(均P<0.05)，因此血清miR-629及miR-24水平的检测可能有助于评估肝癌患者的病情[15-16]。

目前认为慢性肝炎→肝硬化→非典型增生→肝癌是肝组织肿瘤化过程中的重要病理变化，但由慢性肝炎到肝癌恶性转化过程(即肿瘤化)中关键的分子事件并未完全清楚[17]。前期研究表明，DNA 损伤修复功能缺陷在慢性肝炎的恶性转化过程中可能起重要作用，而 miR-24/miR-629 在消化系统癌组织中出现异常表达[18-19]。MiR-629、miR-24这两种miR的高表达受核因子激活的B细胞的κ-轻链调控，且这种异常在具有慢性肝炎背景的组织中更为明显，这提示 DNA 损伤及 miR-24/miR-629 间可能存在一种网络关系，并可能在慢性肝炎的恶性转化过程中起重要作用[20]。因此，深入研究 DNA 损伤/miR-24/miR-629 在慢性肝炎的恶性转化过程中的作用具有重要科学价值，其有助于阐明慢性肝炎由可控到不可控、再到恶性转化过程中的关键分子事件，并对进一步认识肝癌的发生机制、加强肝癌的防治具有重要意义[21]。本研究结果显示，正常对照组、乙肝组、肝癌组的血清miR-24、miR-629的相对表达水平依次升高(均P<0.05)，表明随着肝脏病变严重程度的增加，血清中的miR-629及miR-24的水平也逐渐升高，这提示miR-24、miR-629在慢性肝炎的恶性转化过程中起重要作用。

综上所述，肝癌患者癌组织及血清中的miR-629、miR-24的表达水平均上调，其可能在肝癌的发生以及慢性肝炎的恶性转化过程中起到重要作用，而血清miR-24和miR-629的检测或有助于评估肝癌患者的病情。