川芎嗪对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响▲

肖 敏 徐洪来

(广西柳州市人民医院1 皮肤科，2 肝胆外科，柳州市 545006，电子邮箱：501880191@qq.com)

恶性黑素瘤简称为黑素瘤，起源于黑素细胞，恶性程度高，进展迅速，极易发生远处转移，致死率高，预后差[1]。目前黑素瘤的治疗方法有手术、化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗等，但效果均不理想[2]。尤其是针对黑素瘤的化疗药物常难以渗透至肿瘤深部，且毒副作用大，极易发生耐药，疗效并不显著[3]。近年来，有关中草药治疗恶性肿瘤的研究日益增多，寻找治疗黑素瘤的敏感中药已成为目前研究的热点。最近的研究显示，川芎嗪具有较好的抗肿瘤效应[4]。但川芎嗪对黑素瘤细胞的作用还鲜有研究报告。本研究探讨川芎嗪对人恶性黑素瘤A875细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响，旨在为临床治疗黑素瘤提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物和试剂 人皮肤恶性黑素瘤A875细胞(中国典型培养物保藏中心)；川芎嗪(远大医药中国有限公司，批号：H42021600)；RPMI 1640培养基(美国HyClone公司，批号： SH30809.01B)；四甲基偶氮唑盐试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：G4101)；一抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)3兔单抗(美国Abcam公司，批号：ab44976)，环氧化酶(cyclooxygenase，COX)-2兔单抗(北京中彬金桥生物技术有限公司，批号：ZA.0515)，二抗(北京中彬金桥生物技术有限公司，批号：ZF.0311)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：将人黑素瘤A875细胞置于含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基中，于5% CO2、37℃、相对湿度90%的条件下传代培养，每2天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞增殖检测：将人黑素瘤A875细胞接种于96孔培养板，密度为1×104/孔，在5% CO2、37℃、相对湿度为90%的条件下培养24 h，待细胞贴壁后，将其分别加入川芎嗪浓度为0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL的培养基中(其中0 mg/mL川芎嗪培养基组为阴性对照组)，每组均设6个复孔，于5% CO2、37℃、相对湿度为90%的培养箱内分别孵育48 h、72 h后终止培养，更换不含川芎嗪的新鲜无血清培养基。每孔加入四甲基偶氮唑盐溶液20 μL，继续孵育4 h，弃上清后加入150 μL二甲基亚砜。用酶标仪(美国Therme Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop 2000)于570 nm波长下测定各孔A值，计算细胞存活率。以0 mg/mL川芎嗪培养基组为对照组，细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.2.3 Caspase3、COX-2蛋白检测：采用蛋白免疫印迹法检测Caspase3、COX-2蛋白表达水平。将人黑素瘤A875细胞在5% CO2、37℃、相对湿度为90%的条件下培养24 h，待细胞贴壁后置入浓度为2 mg/mL的培养基中，分别培养0 h、48 h、72 h，每组均设6个复孔。同时以川芎嗪终浓度为0 mg/mL的培养基培养细胞0 h、48 h、72 h作为阴性对照。收集细胞，磷酸盐缓冲液冲洗2次，1 min/次，裂解细胞，加入适量RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。将含有等量蛋白的细胞裂解液用5×上样缓冲液稀释(稀释比例为4 ∶1)，置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(分离胶15%、浓缩胶5%)电泳分离，转膜，室温下用 5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗(1 ∶1 000)，4℃过夜；加碱性磷酸酶标记的二抗(1 ∶500)，37 ℃孵育1 h后，用碱性磷酸酶显色液显色后扫描成像。以β-肌动蛋白为内参照，计算COX-2、Caspase3蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK-q检验；相关分析采用Pearson相关性检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度川芎嗪对A875细胞存活率的影响 川芎嗪培养48 h、72 h时，A875细胞的细胞存活率均随着川芎嗪浓度的升高而降低(均P<0.05)；当川芎嗪浓度为1、2 mg/mL时，A875细胞的细胞存活率随着药物作用时间延长而下降(均P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度川芎嗪对A875细胞的细胞存活率的影响(x±s)

2.2 不同浓度川芎嗪对A875细胞COX-2、Caspase3蛋白相对表达水平影响 0 mg/mL川芎嗪干预时，各时间点A875细胞COX-2蛋白、Caspase3蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；2 mg/mL川芎嗪干预时，A875细胞COX-2蛋白相对表达水平随时间延长而降低，Caspase3蛋白相对表达水平随时间延长而升高(均P<0.05)。培养48 h、72 h时，与0 mg/mL川芎嗪组比较，2 mg/mL川芎嗪组的COX-2蛋白相对表达水平降低，Caspase3蛋白相对表达水平升高(均P<0.05)。见表2、表3。

表2 不同浓度川芎嗪干预后A875细胞COX-2蛋白相对表达水平(x±s)

表3 不同浓度川芎嗪干预后A875细胞Caspase3蛋白相对表达水平(x±s)

2.3 COX-2、Caspase3蛋白相对表达水平的相关性分析 2 mg/mL川芎嗪处理A875细胞48 h、72 h，COX-2蛋白与Caspase3蛋白的相对表达水平均呈负相关(r=-0.851，P=0.032；r=-0.974，P=0.001)。

3 讨 论

肿瘤是一种细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是细胞凋亡异常的疾病[5]。增殖失控和凋亡失常是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要生物学特征[6]。增殖失控指肿瘤细胞无限制增殖，使得肿瘤细胞数量快速增多。细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是指细胞为维持内环境稳定，由多基因严格控制的细胞自主且有序的死亡，其特征包括各种细胞形态学的改变，包括细胞皱缩、染色体浓缩、核碎裂、凋亡小体形成等[7]。肿瘤细胞凋亡率与肿瘤细胞生长率呈负相关[8]。细胞凋亡过程涉及一系列蛋白家族，包括Caspase蛋白家族，这些蛋白与细胞凋亡的形态学特征变化(如细胞膜空泡变性、核膜破裂、染色质聚集或染色体边聚、DNA断裂等)以及生化改变(如DNA修复相关酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白的灭活或下调等)密切相关[9]。Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行因子之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[10]。COX又称前列腺素过氧化物合成酶，是一种膜结合蛋白，具有环氧合酶和过氧化物合成酶的双重功能，是前列腺素合成起始步骤的关键酶[11]，其中COX-2又称诱生型COX。在正常组织中几乎不能检测到COX-2，但在异常增生组织及恶性肿瘤中COX-2呈高表达，且肿瘤的恶性程度越高，COX-2蛋白表达阳性率越高[12]。COX-2可通过抑制线粒体凋亡途径，抑制Caspase9、Caspase3的激活，从而抑制细胞凋亡，增加肿瘤的侵袭力，参与肿瘤的发生、发展和转移[13]。

川芎嗪又名天然四甲基吡嗪，属酰胺类生物碱，可从伞形科植物川芎中提取，是中药川芎的主要有效成分，能够改善脑血流和微循环，扩张小动脉，具有活血化瘀的功效，临床上主要用于治疗闭塞性脑血管疾病(如脑供血不全、脑血栓形成、脑栓塞等)，或缺血性心血管系统疾病(如脉管炎、心绞痛、冠心病等)[14]。近年来，研究表明川芎嗪具有较好的抗肿瘤效应，可调节肿瘤免疫、降低肿瘤的侵袭与转移能力，尤其是能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡[15]。研究显示，川芎嗪能够明显抑制神经胶质瘤、肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、骨肉瘤等肿瘤细胞的生长，并诱导肿瘤细胞的凋亡[16-19]。但川芎嗪对人黑素瘤A875细胞的作用如何，目前尚不清楚。

本研究结果显示，经川芎嗪干预48 h、72 h，A875细胞的细胞存活率随着川芎嗪浓度的升高而降低(P<0.05)；当川芎嗪浓度为1或2 mg/mL时，A875细胞的细胞存活率随着药物作用时间延长而下降(P<0.05)。这提示川芎嗪具有抑制黑色素瘤A875细胞增殖的作用，且呈一定程度的时间、浓度依赖性。此外，经2 mg/mL川芎嗪干预48 h、72 h后，A875细胞COX-2蛋白相对表达水平降低，Caspase3蛋白相对表达水平升高(P<0.05)，且均呈现出一定的时间依赖性；此外2 mg/mL川芎嗪干预A875细胞48 h、72 h后，COX-2蛋白与Caspase3蛋白的相对表达水平均呈负相关(P<0.05)。这提示川芎嗪可能通过抑制COX-2的活化，促进Caspase3的高表达，从而诱导A875细胞的凋亡，抑制A875细胞的增殖，达到抗黑素瘤的作用。

综上所述，川芎嗪能抑制A875细胞增殖，并可川芎嗪抑制COX-2活化、上调Caspase3表达水平，从而诱导细胞凋亡。