蜕膜巨噬细胞中Siglec-11的表达及其与复发性自然流产的相关性研究

李 倩，郑青亮

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是妊娠常见并发症，发生率约为1%，其中50%以上患者不存在染色体、解剖、内分泌、自身免疫异常和生殖道感染等常见病因，临床上称之为原因不明复发性流产，其发病机制不清楚，缺乏有效的治疗方法。生殖免疫学研究认为母胎免疫耐受异常可能是其发病机制之一[1]。

免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins，Siglecs)家族是表达于各种免疫和造血细胞表面的一类免疫球蛋白粘附分子，通过识别含有唾液酸的糖链结构促进细胞与细胞的相互作用，介导细胞信号的转导，调节免疫细胞和造血细胞的功能。近年来的研究发现，其在免疫调节和炎症反应中发挥重要的作用，并且还有介导胞吞作用病原体识别等功能[2-4]。

Siglec-11是公认的粘附分子，介导唾液酸与细胞的结合，与多糖配体特异结合以减少炎症反应的发生。在免疫应答中，配体通过SH2结构域募集细胞质磷酸酶诱导酪氨酸磷酸化,而Siglec-11作为其抑制性受体，通过信号分子的去磷酸化阻断信号通路。Siglec-11主要在人体内各种组织中的巨噬细胞中表达，在巨噬细胞介导的免疫应答中起重要作用[5-6]。本研究分析RSA妇女与人工流产妇女蜕膜组织中巨噬细胞Siglec-11的表达差异，初步探讨Siglec-11在蜕膜巨噬细胞的调控及RSA中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—2018年12月上海市第一妇婴保健院门诊84例RSA患者为RSA组，患者自然流产连续发生3次或3次以上，常规进行病因筛查；排除夫妻染色体、解剖、内分泌、感染因素及自身免疫性疾病，排除胎儿染色体芯片结果异常的病例；RSA组年龄(30.86±3.24)岁，胎龄(64.52±10.60)d,体重指数(24.28±4.44)。同期要求人流的正常妊娠妇女84例为对照组；妊娠期间无阴道异常出血，B超检查提示胚胎发育正常；正常妊娠组年龄(29.59±6.08)岁，胎龄(61.62±14)d，体重指数(22.91±6.20)。2组年龄、胎龄、体重指数基线资料比较差异无统计学意义。所有样本在采集和使用前均与患者签署知情同意书，研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 血液和蜕膜组织的取材和处理 正常早孕妇女和RSA患者于人流术前抽取无抗凝血，离心分离血清，-80 ℃保存。于人流术中无菌取蜕膜组织，用生理盐水清洗，取0.5 cm×0.5 cm×1 cm的组织3块，分成3管置于液氮中保存。用于提取总RNA和蛋白质，另取约2 cm×1 cm×1 cm的蜕膜组织，浸泡于福尔马林中过夜，制作石蜡包埋组织及芯片。

1.2.2 免疫组化 切片，烤片，二甲苯溶蜡，酒精梯度水化。柠檬酸修复液煮沸修复，自然冷却，自来水冲洗，滴加3%的H2O2蒸馏水溶液，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS浸洗，血清或BSA封闭，一抗(abcam106390)按1:100稀释，4 ℃过夜孵育，次日PBS浸洗，每张切片滴加二抗工作液(HRP 1∶100)，37 ℃温箱孵育30 min。PBS浸洗，DAB(SignalStain®DAB Substrate Kit)(CST,#8059)显色，镜下观察，抗体标记的阳性部位准确终止显色。苏木素复染，1%酸酒精分化，自来水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.3 免疫荧光 烤片，二甲苯溶蜡，酒精梯度水化。柠檬酸修复液煮沸修复，自然冷却，PBS浸洗，血清或BSA封闭，一抗(abcam106390)按1∶100稀释，4 ℃过夜孵育，次日PBS浸洗，滴加荧光二抗工作液(abcam150115 1∶1 000)，常温孵育1 h。PBS浸洗，每张切片滴加FITC标记CD14荧光二抗(Biolegend,catalog no.325604)，常温孵育1 h，标识巨噬细胞。PBS浸洗，DAPI染核。用加抗淬灭剂的封片剂封片。注意避光操作。

1.2.4 组织芯片的制作 组织芯片仪为购自韩国UNITMA公司的Quick-Ray，组织切片机为德国Leica公司2145型。由高年资病理医生对供体蜡块及相对应的HE切片复片，镜下选取目标区域，用Marker笔在玻片上标记，并在供体蜡块选取对应区域和准确定位。根据预先的设计选取合适规格的受体蜡块，按照组织陈列设计图将相应蜡块按顺序排好，用芯片仪配套1 mm的钻头分别钻取标记出的组织位点，按照顺序分别注入受体蜡块相应的孔洞，直至依次将所有标本植入。将组织芯片面朝下放入溶蜡框，放入恒温箱内，50 ℃溶蜡30 min，包埋。

1.2.5 实时定量荧光PCR(real-time quantitative-PCR,qRT-PCR)检测 TRIZOL(美国Invitrogen公司)法从RSA组和对照组蜕膜组织中提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书Toyobo(日本Osaka公司)进行反转录反应，qRT-PCR分析，PCR引物序列：h-Siglec-11正链：CACTGGAAGCTGGAGCATGG；h-Siglec-11反链：ATTCATGCTGGTGACCCTGG。采用2-ΔΔCt法处理数据。

1.2.6 ELISA检测 ELISA试剂盒检测RSA患者和对照组血清中Th1型细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-2和干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)，Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达水平。试剂盒购自上海语纯生物科技有限公司。严格按照说明书进行测定，尽量减少误差。

2 结果

2.1 2组患者蜕膜组织中Siglec-11在转录组水平上的比较 TRIZOL法从RSA组和正常对照组蜕膜组织中提取总RNA，qRT-PCR检测Siglec-11在蜕膜组织中的表达。结果显示，与对照组(93.93±39.09)比较，RSA组(31.6±5.01)Siglec-11在转录组水平上显著下调(n=7，t=4.184,P<0.05)。

2.2 2组患者蜕膜组织中Siglec-11蛋白原位表达情况的比较 利用免疫组织化学染色对Siglec-11的表达进行定位，结果表明，阳性染色主要出现于细胞膜和细胞质中(图1)，使用Image J插件IHC Profiler处理图像。基于蜕膜组织中的DAB染色强度为所有组织分配评分(0，无染色；1，低阳性；2，阳性；3，高阳性)。与对照组比较，RSA组Siglec-11蛋白在蜕膜组织切片上的原位表达显著下调(n=6，Scale bars,200 μm)。

利用免疫荧光双染技术对蜕膜组织中的巨噬细胞用CD14标记(绿色荧光)和Siglec-11抗体用红色荧光标记。结果表明，2组患者蜕膜组织中均可见CD14与Siglec-11的共染现象。且Siglec-11主要在蜕膜巨噬细胞的细胞膜和细胞质中表达。RSA组CD14+Siglec-11+细胞比例显著低于对照组，差异比较具有统计学意义(t=2.915,P<0.05)。图2。

图1 2组患者蜕膜组织中Siglec-11蛋白原位表达情况

注：Siglec-11主要在巨噬细胞的细胞膜和细胞质中表达(图中箭头所示)；与对照组比较，Siglec-11在RSA蜕膜组织中的表达下调，荧光染色偏弱(Scale bars,75 μm)图2 Siglec-11在2组蜕膜组织中与巨噬细胞共染的免疫荧光图像

2.3 组织芯片验证 通过高通量组织芯片的构建，进一步验证Siglec-11在RSA组和对照组组织中的表达差异，使用Image J插件IHC Profiler处理图像。对每个组织芯片的免疫组化染色结果评分。RSA组和对照组得分差异比较具有统计学意义(P<0.05)。表1。

表1 RSA组和正常对照组组织芯片免疫组化染色评分结果

2.4 ELISA法检测2组血清中Th1/Th2型细胞因子水平 RSA组IL-2的表达水平(9.34±0.61)明显高于对照组(3.55±0.41)，差异比较具有统计学意义(t=7.83,P<0.05)。RSA组的IFN-γ表达水平(664.40±14.86)明显高于对照组(481.80±17.27)，差异比较具有统计学意义(t=8.015,P<0.05)。

RSA组IL-4的表达水平(12.77±0.64)明显低于对照组(21.57±1.55)，差异比较具有统计学意义(t=5.242,P<0.05)。RSA组IL-10的表达水平(15.55±1.1)明显低于对照组(24.59±1.21)，差异比较具有统计学意义(t=5.522,P<0.05)。

3 讨论

巨噬细胞是机体天然免疫系统的重要组成部分，属于抗原递呈细胞，对于机体细胞免疫的启动具有重要意义。研究表明，早孕期母体巨噬细胞在子宫局部的激活和过多浸润是导致自然流产和子痫前期等病理妊娠的重要原因，但其具体机制目前却不清楚[7-8]。巨噬细胞在母胎界面的免疫耐受形成中起枢轴作用，不仅分泌细胞因子如：IL-6,IL-10,TNF-α,IFN-γ等参与妊娠子宫细胞因子网络系统，还可通过其分泌的细胞因子直接调控T细胞的增殖、分化，从而影响Th1/Th2比值[9]。

本研究发现，病例组蜕膜巨噬细胞中Siglec-11在转录和蛋白表达层面上均显著下调，且与血液中Th1/Th2型细胞因子的表达显著相关。推测Siglec-11在RSA中的作用机制为蜕膜巨噬细胞中Siglec-11在转录组和蛋白组水平的变化影响巨噬细胞的极性分化，导致妊娠过程中以Th2型细胞因子占主导的免疫平衡状态发生改变，更加倾向Th1型细胞因子占主导的免疫失衡状态转化，最终导致流产的发生。

母胎界面免疫状态的形成和维持是妊娠过程得以建立和顺利进行的关键,而蜕膜免疫细胞在其中发挥了重要的调控作用。在妊娠早期的蜕膜组织中,蜕膜巨噬细胞(dMΦ)由MΦ1转变为MΦ2型,发挥抗炎和吞噬作用,调节蜕膜局部的免疫功能,参与调控胚胎植入和妊娠维持过程[10-11]。

本研究主要关注Siglec-11在母胎界面的免疫学功能，对阐述反复性妊娠失败的原因以及提高RSA的免疫治疗成功率均有重要意义，为探讨妊娠中母胎界面的相互作用机制开辟了新思路，可能成为RSA干预的潜在靶点之一，有助于深入了解RSA的发病机制，为临床诊断治疗提供新的理论依据。然而Siglec-11表达发生变化的调控机制，上下游的信号分子以及信号通路，精确的免疫学调节机制等都不太明了，尚待进一步研究。