毛蚶体内金属硫蛋白提取工艺优化

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(1.浙江省海洋水产研究所,浙江省海洋渔业资源可持续利用研究重点实验室,浙江舟山 316000;2.浙江工商大学,浙江杭州 310000;3.浙江海洋大学，浙江舟山 316000)

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类广泛存在于生物中的低分子质量(6～7 kDa)、无芳香族氨基酸、富含半胱氨酸的金属结合蛋白[1-2]。MT分子易与锌、铜、镉重金属离子等结合,是一类可诱导的蛋白。在过去的研究中,采用铜、锌、镉等重金属饲喂或注射动物诱导其产生MT[3]。MT中大量巯基赋予了其螯合重金属离子功能及重金属解毒作用,可调节生物体内微量元素浓度。MT清除自由基的能力明显强于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽,调节细胞代谢、增殖分化。其在食品、医药、保健、环境、化妆品、生物工程等领域中应用广泛[4-5]。目前国内市场上,MT纯度在95%以上约20 万/g[6],价格昂贵使研究应用受到限制。因此建立MT的高效提取工艺具有重要意义。毛蚶属于滤食性双壳贝类,体内易富集重金属,且价格低廉易于养殖,资源丰富[7],是提取金属硫蛋白的理想原材料。

目前关于金属硫蛋白的提取已有部分研究,多数采用缓冲液浸提离心法,但发现MT在天然动物体内含量较低,大大影响了其提取效率,而且任何目标产物或蛋白质的提取都需经过漫长的柱层析纯化过程,因此,原材料中目标产物或蛋白的含量是制约其提取效率的关键点,因此在进行提取前如何提高天然动物中目标产物或蛋白质的含量具有重要意义。本研究选取毛蚶为研究对象,通过Zn2+诱导毛蚶体内产生 MT[8-9],并优化了提取工艺。通过研究提取液浓度、液料比、提取温度、提取液pH等提取因素对提取液中MT含量的影响,在单因素的基础上通过响应面优化试验,得到MT最佳的提取条件,为下一步金属硫蛋白的分离纯化提供原材料,同时为MT的产业化生产和产品开发应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛蚶 购自浙江省舟山市东河水产批发市场,壳长(5±0.5) cm,壳高(3±0.5) cm,体重:30～40 g;三羟甲基氨基甲烷(Tris) 生物试剂纯,北京索莱宝科技有限公司;5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 色谱纯,上海安谱实验科技股份有限公司;兔肝-MT对照品 纯度98.5%,大连联合博泰生物技术有限公司;乙二胺四乙酸二钠、盐酸、柠檬酸、磷酸氢二钠 均为优级纯,国药集团。

UV-3100BPC紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;T18匀浆机 德国艾卡(ULTRAT-URRAX);JXN-30高速冷冻离心机 贝克曼库尔特(Beckman Coulter Avanti);ETHOS UP微波消解仪 迈尔斯通(Milestone);7900电感耦合等离子体质谱仪 安捷伦;LABCONCO冻干机 北京中科科尔仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 毛蚶体内 MT 的诱导表达 选取生长活力良好的毛蚶个体,擦洗去除体表粘附的生物后放入玻璃养殖箱中,20只/箱,箱内注入充氧气的天然海水(盐度24‰±1‰,pH8.0±0.2,水温(23±1)℃),暂养2 d,期间不投喂饵料。之后每天更换含50 μmol/L氯化锌海水,期间不投喂饲料,诱导 7 d后,取出毛蚶个体,在 0～4 ℃条件下解剖毛蚶,将其组织匀浆后,置于-60 ℃条件下贮存备用[10]。

1.2.2 毛蚶中金属元素的测定 参考现行国标GB 5009.268-2016测定毛蚶中的金属元素。取适量组织微波消解后,使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定毛蚶中Zn元素含量[11]。

1.2.3 毛蚶中MT含量的测定 采用5,5′-二硫硝基苯甲酸(DTNB)作为金属硫蛋白(MT)巯基衍生化试剂,通过比色法测定412 nm波长处显色产物硫代硝基苯甲酸阴离子(TNBA)的量确定金属硫蛋白含量[12]。该方法简单快捷,精密度良好,线性回归方程为:y=0.0065x-0.0044(R2=0.9995)。

1.2.4 毛蚶中MT的提取

1.2.4.1 单因素实验 取毛蚶组织约 2 g,按提取液∶组织匀浆液比例分别为2∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1 mL/g,加入0.1 mol/L,pH为 8.0的Tris-HCl提取液,40 ℃恒温水浴振荡(转速180 r/min)提取90 min后,4 ℃下,8000 r/min离心20 min,收集上清液测定MT含量,研究液料比对毛蚶MT提取量的影响。

取毛蚶组织约2 g,按提取液∶组织(mL/g)比例6∶1加入0.1 mol/L,pH8的Tris-HCl提取液,充分混匀,分放在20、30、40、50、60、70 ℃的条件下恒温水浴振荡提取90 min 后,4 ℃下,8000 r/min离心20 min,收集上清液测定MT含量,研究提取温度对毛蚶MT提取量的影响。

取毛蚶组织约2 g,按提取液∶组织(mL/g)比例6∶1分别加入到pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.1 mol/L Tris-HCl提取液,40 ℃恒温水浴振荡提取90 min 后,充分混匀,4 ℃,8000 r/min离心20 min,收集上清液测定MT含量,研究缓冲液pH对毛蚶MT提取量的影响。

取毛蚶组织约2 g,按提取液∶组织(mL/g)比例6∶1分别加入到pH为8浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L Tris-HCl提取液,40 ℃恒温水浴振荡提取90 min后,充分混匀,4 ℃ 8000 r/min离心20 min,收集上清液测定MT含量,研究提取液浓度对毛蚶MT提取量的影响。

1.2.4.2 响应面试验 在单因素实验基础上,根据Design-Expert 8.0软件进行响应面实验设计,在四因素三水平的基础上进行响应面实验,进行毛蚶金属硫蛋白提取工艺响应面优化分析。试验因素和水平设计表见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计Table 1 Response surface test factors and levels

1.3 数据处理

采用Origin 9.1 绘制曲线,Design-Expert8.0.6进行响应面的绘制,应用SPSS 17.0进行方差分析,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 诱导前后毛蚶组织中Zn2+和MT含量变化

ICP-MS检测Zn2+元素标准曲线方程:y=3.7561E-005X+0.0013,r=0.9997。本实验采用对生物体毒害作用小的锌离子诱导。由表2可知,采用50 μmol/L氯化锌诱导效果显著(P<0.05)。毛蚶组织中Zn2+含量与MT含量显著提高(P<0.05),说明毛蚶在Zn2+诱导下,体内MT合成增加。

表2 诱导前后毛蚶组织中 Zn2+和MT 含量Table 2 The contents of Zn2+ and MT in theArca subcrenata tissues before and after induction

2.2 单因素结果分析

2.2.1 液料比对毛蚶MT提取含量的影响 Tris-HCl缓冲液性质稳定,与生理体液的相容性好,采用Tris-HCl缓冲液提取毛蚶中MT,不仅有效促进蛋白的溶出,并提供稳定的环境,减少蛋白的变性[6,13]。由图1可知,在提取过程中,随着提取液体积增加MT含量逐渐提高;当液料比为6∶1时,MT含量达到最大值为0.406 mg/g;继续增大提取液的量,MT提取含量变化趋于平缓,说明当液料比达到一定值时,对MT提取含量不再有显著影响(P>0.05)。提取液过多会降低提取液中MT的浓度,对后续的测定和使用造成不便,同时还增加了提取成本。因此,初步确定毛蚶组织与提取液的液料比为4∶1～6∶1 mL/g。

图1 液料比对毛蚶MT提取含量的影响Fig.1 Effect of material ratio on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.2.2 提取温度对毛蚶MT提取含量的影响 研究表明,金属硫蛋白具有很好的热稳定性,在80 ℃条件下加热3 min后变性失活[14],因此提取温度设置在20～70 ℃范围内。由图2可知,随着提取温度的增加,MT含量增大,随后逐渐降低。温度达到40 ℃时MT含量达到最大。温度继续升高可能会破坏MT的活性。有学者认为,短时间高温加热,可除去杂蛋白,但是时间尚未确定,存在较多弊端[15]。因此,初步确定提取温度为30～50 ℃。

图2 提取温度对毛蚶MT提取含量的影响 Fig.2 Effect of temperature on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.2.3 提取液pH对毛蚶MT提取含量的影响 蛋白质在等电点(pI)时,其溶解度最小,最易形成沉淀物,水生生物MT的pI通常在3.5～6.0范围内[16],因此提取液pH设置在3～9范围内。由图3可知,pH对提取效果影响较大,随着提取液pH的变化,MT提取含量先增加再降低。因此,初步确定最佳提取液pH为8。

图3 提取液pH对毛蚶MT提取含量的影响 Fig.3 Effects of pH on extraction of MT from Arca subcrenata

2.2.4 提取液浓度对毛蚶 MT 提取含量的影响 由图4可知,在0.01～0.5 mol/L范围内,MT含量呈现先上升后下降的趋势。在0.1～0.2 mol/L范围内呈现最大值。因此,初步确定最佳提取液浓度为 0.2 mol/L。

图4 提取液浓度对毛蚶MT提取含量的影响Fig.4 Effects of buffer concentration on theextraction of MT from Arca subcrenata

2.3 响应面优化试验结果及分析

2.3.1 响应面试验结果 根据单因素实验结果,选取对MT提取效果具有显著影响的4个单因素,即提取液pH(A)、提取温度(B)、提取液浓度(C)、液料比(D)。通过Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken中心组合设计原理进行试验,得到线性回归方程,对回归方程系数进行分析,得到毛蚶中MT最佳提取条件。试验因素和水平设计见表1。以提取液中MT含量为响应值,进行29组实验,其中包括24组析因实验及5组中心实验用来估算误差,结果如表3所示。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 二次多项模型方差分析Table 4 ANOVA for the quadratic polynomial model

2.3.2 响应面试验结果分析 利用Design Expert 8.0.6软件,对表3中实验数据进行分析得到表4。以提取液中MT含量为响应值,对响应值与四个因素进行回归拟合后,得到回归方程如下:R=0.66-2.635E-003A-0.077B-0.027C+0.093D-0.10AB+3.714E-0.03AC+0.027AD-2.128E-003BC-0.020BD+0.084CD-0.089A2-0.13B2-0.058C2-0.068D2。

图5 温度和提取液pH对MT提取效果的影响Fig.5 Effect of pH and temperature on the extraction of MT from Arca subcrenata

图6 提取液pH和提取液浓度对MT提取效果的影响Fig.6 Effect of pH and buffer concentration on the extraction of MT

P值的大小代表了模型与各单因素的显著水平[17],由表4方差分析可知:模型的P<0.0001,表明实验采用的二次模型是极其显著的,在统计学上有意义。失拟项反映了所用模型与实验的拟合程度,即两者差异程度。失拟项的P=0.055>0.05,说明实验结果与该方程模型失拟不显著,拟合程度较好,可用该模型推测实验结果。由表4还可以看出,四个因素中,交互相AB、CD对MT含量具有极显著影响(P<0.01)。本模型中，决定系数R2=0.90,变异系数 C.V.=10.9%,说明该模型能够解释90%的响应值变化,即该模型拟合程度良好,实验误差较小,适合于毛蚶中MT提取量的分析和预测。由P值可以看出,不同提取因素对MT含量影响的顺序为:液料比>提取温度>提取液浓度>提取液pH。此外,Pred R-Squared值(0.446)与Adj R-Squared值(0.805)相差很大,亦表明该响应面方程需要做进一步的优化。

图7 提取液pH和液料比对MT提取效果的影响Fig.7 Effect of pH and material ratio on the extraction of MT

响应面是由测试因子和响应值组成的三维立体曲面图。它的等高线图直观地反映了变量之间相互作用的显著程度。圆形表示双因素相互作用不显著且可以忽略,而椭圆表明这两个因素具有显著的相互作用。等高线越密集,因素变化对响应值的影响越大。在同一椭圆区域中,响应值在椭圆的中心点处是相同的,即从中心到边缘递减[18]。由图5～图10可知,响应面开口朝下,随着每个因素的增大,响应值增大,当响应值达到极大值后,随每个因素的增大,响应值逐渐减小。该模型具有稳定点,且稳定点是最大值。AB、CD交互作用的等高线图为椭圆形,说明AB、CD的交互作用对MT含量有显著影响,其他两因素的等高线图均为圆形或近圆形,说明对MT含量的影响不显著。

由Design-Expert8.0软件分析,得出最优提取条件为:提取液pH8.45,提取液浓度0.18 mol/L,提取温度35 ℃,液料比为 6∶1。在实验可行范围内进行三个平行实验,提取液中MT提取含量均值为0.695 mg/g,MT提取模型的理论最佳值为0.702 mg/g,两者之间差值为7 μg/g,测定结果稳定,偏差不大,证明该结果合理可靠。两者吻合度较高,说明该模型可行,为毛蚶中MT的进一步纯化与研究提供技术支持。

3 讨论与结论

图8 提取液温度和提取液浓度对 MT 提取量效果的影响Fig.8 Effect of temperature and buffer concentration on the extraction of MT

图9 提取温度和液料比对MT提取量的影响Fig.9 Effect of temperature and material ratio on the extraction of MT

图10 提取液浓度和液料比对MT提取效果的影响Fig.10 Effect of buffer concentration and material ratio on the extraction of MT

选取易于富集重金属的毛蚶为提取原料,使用50 μmol/L氯化锌诱导毛蚶体内合成MT,诱导前后毛蚶组织Zn2+含量由0.0218 mg/g增加到0.0724 mg/g,MT含量由0.2917 mg/g增加为0.6503 mg/g,诱导效果显著(P<0.05)。Zn2+增长量为0.0506 mg/g,提取液中MT增长量为0.258 mg/g,说明在急性ZnCl2暴露过程中,毛蚶体内快速合成MT,诱导效果显著。本研究与本团队前期利用虾夷扇内脏提取金属硫蛋白[6]相比,虾夷扇贝内脏是较好的提取制备MT的原料,虽然内脏中MT含量较肌肉中多,但将虾夷扇贝内脏中MT含量与经诱导后的毛蚶体内MT含量相比,虾夷扇贝内脏中MT含量相对较低。而且毛蚶价格低,资源充足,经诱导后发现毛蚶体内的MT含量要远高于虾夷扇贝和褶牡蛎体内[13]MT含量。所以,从性价比及MT提取含量两方面考虑,毛蚶可以作为提取金属硫蛋白的理想原材料。研究表明,MT的α结构域结合4个二价金属离子,β结构域结合3个二价金属离子[19],低等的甲壳类如龙虾无α域,只含两个β域[20],贝类MT的结构还未见报道,但MT的进化具有高度保守性。对于以毛蚶为原料提取MT,液料比、提取温度及提取液pH对提取液中MT含量具有极显著影响(P<0.01),故在后期工业化生产中应对这三种因素设置关键控制点。

经本研究发现,以毛蚶为原料提取MT时,先将毛蚶用Zn2+诱导暂养7 d,可大大提高其体内MT的含量,实现高效提取。经单因素和响应面实验优化后发现其最佳提取工艺为:提取液pH8.45,Tris-HCl提取液浓度0.18 mol/L,提取温度35 ℃,液料比为6∶1。在实验可行范围内进行三个平行实验,提取液中MT提取含量均值为0.695 mg/g。本研究可为贝类加工企业充分合理利用加工下脚料提供一定参考,存在的缺点或不足之处在于,针对贝类内脏团极易富集重金属的特点,应将内脏团和其他组织分离后各自提取MT,得到内脏团和其他组织中MT含量的数据。