SORBS1基因甲基化在Hcy诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

梁雅茹陈培松李齐光

1.广州医科大学附属第六医院，广东 清远511518；2.中山大学附属第一医院，广东 广州510630

研究表明，高浓度的同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）通过损伤血管内皮细胞、促进氧化应激和炎症反应等导致内皮功能失调，引发动脉粥样硬化（arthrosclerosis，AS）等心脑血管疾病［1，2］，但Hcy如何导致动脉粥样硬化等心脑血管疾病的作用机制并不完全清楚。近年来，随着表观遗传学研究的深入，多个研究表明DNA甲基化与心脑血管疾病，尤其是动脉粥样硬化的发生关系密切［3，4］。Hcy是甲硫氨酸循环的中间产物，其病理性升高影响机体的DNA甲基化过程，从而影响某种基因的表达而导致心脑血管疾病的发生。因此，本文旨在研究高浓度的Hcy诱导人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）发生氧化应激的过程中是否存在某种基因DNA甲基化水平的变化，为Hcy致动脉粥样硬化等心脑血管疾病发病机制的研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 主要材料 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（本实验室前期培养冻存细胞）；Human endothelium SFM培养基（Gibco），Hcy、叶酸（Fc）、维生素B12（Sigma），FSQ-101 ReverTra Ace qPCR RT Kit cDNA合成试剂盒（TOYOBO），EZ DNA甲基化试剂盒（ZYMO research），SORBS1实时荧光PCR引物（Thermo Fisher），兔抗人SORBS1抗体（Novus Biologicals），兔抗人SOD2抗体（Santa Cruz），MDA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），BSP引物（上海生工生物工程股份有限公司），Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒（Invitrogen），SORBS1 siRNA序列（广州永诺生物科技有限公司）；PCR扩增仪、3730测序列分析仪（ABI）公司，凝胶成像仪（Alfa Innotech），紫外-可见分光光度计（Hitachi）。

1.2 实验方法 将前期培养冻存的HUVEC复苏后传代培养至第三代，分成四组，细胞密度均为1×106个/瓶，分别为：①Hcy组：1mmol/L Hcy；②叶酸组（Hcy+Fc）：1mmol/L Hcy+100μmol/L叶酸；③叶酸+VitB12组（Hcy+Fc+VitB12）：1mmol/L Hcy+100μmol/L叶酸+100 μmol/L VitB12；④空白对照组：未处理的HUVEC；按DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用Infinium Human Methylation450 BeadArray基因芯片法筛选出差异甲基化位点；用BSP法验证筛选出基因SORBS1在4组细胞中的甲基化水平；分别用Western blot和RT-PCR法检测4组细胞SORBS1分子的表达，按Lipofectamine-TM 2000转染试剂盒说明书进行细胞转染，转染实验分为三组：SORBS1-siRNA组（转染SORBS1-siRNA的HUVEC）、NC-siRNA组（转染NC-siRNA的HUVEC）和Blank组（未加处理的HUVEC）；分别用Western blot和RT-PCR法检测三组细胞SORBS1、SOD2的表达差异，用硫代巴比妥酸（TBA）比色法检测三组细胞MDA含量的表达差异。Western blot：于凝胶成像仪上以化学发光模式测定结果，以SORBS1/SOD2分别与GAPDH的蛋白条带灰度比值作为半定量结果。RT-PCR：实验完成后分析扩增曲线和熔解曲线，Real-Time PCR仪的系统软件自动计算SORBS1、SOD2基因的ΔCt、ΔΔCt以及RQ值（RQ=2-ΔΔCt），用RQ值表示SORBS1、SOD2 mRNA的相对表达量，每个标本重复三孔检测，取平均值。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据用“均数±标准差”表示，根据方差齐性检验结果，用单因素方差分析进行多组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选出四组细胞差异甲基化位点 用Subsetquantile Within Array Normalisation（SWAN）算法进行芯片内的归一化处理，对归一化的Beta value（即β）值用柱状图来表示各组数据分布的整体特征，Beta value值区间为（0，1），越接近于1表明甲基化程度越高，越接近于0表明甲基化程度越低。两组样本的AVG.β值相减，差值的绝对值越大代表甲基化的差异程度越大（|beta.difference|＞0.2，甲基化差异有统计学意义）。经过检索文献后发现，仅SORBS1基因曾经报道与心脑血管疾病的发病相关［5］，故选定SORBS1基因做进一步研究。见表1。

2.2 BSP法验证四组细胞SORBS1基因甲基化水平的测序结果 四组细胞SORBS1基因甲基化测序结果基本符合芯片的初筛结果。见表1。Hcy组SORBS1基因甲基化程度较高，其余三组各CpG位点几乎无甲基化，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 四组细胞SORBS1基因Western blot和Real-Time PCR检测结果Hcy组细胞SORBS1表达水平较之空白对照组表达显著下降，而Hcy+Fc组和Hcy+Fc+B12组细胞SORBS1的表达水平较之Hcy组表达显著上调（均P＜0.05）。见图1。

2.4 HUVEC转染后转染效率的测定 荧光显微镜下观察到绿色荧光（GFP）为转染成功，HUVEC细胞转染后于24h，48h和72h分别进行荧光计数，比较各时间点荧光细胞的数量，发现转染72h时绿色荧光表达最高，HUVEC细胞的转染效率在80%以上，可以进行后续实验。见图2。

2.5 检测三组细胞转染72h后SORBS1的表达 与空白对照组和NC-siRNA组相比，SORBS1-siRNA组SORBS1的表达明显降低（P＜0.05），表明SORBS1-siRNA能够抑制目的基因SORBS1的表达水平，达到RNA干扰效果。见图3。

表1初步筛选出四组细胞共有的差异甲基化基因

表2 BSP法验证四组细胞SORBS1基因甲基化水平的测序结果

注：与Blank组相比，*P＜0.05；与Hcy组相比，#P＜0.05

2.6 检测三组细胞转染72h后MDA的含量 与空白对照组和NC-siRNA组相比，SORBS1-siRNA组MDA的含量明显升高（P＜0.05）。见图4。

2.7 检测三组细胞转染72h后SOD2的表达 与空白对照组和NC-siRNA转染组相比，siRNA转染组SOD2的蛋白表达显著降低（P＜0.05），而空白对照组和NC转染组之间SOD2的蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。表明HUVEC细胞干扰抑制SORBS1后，细胞的抗氧化能力降低。见图5。

3 讨论

图2 HUVEC转染72h，NC-siRNA和SORBS1-siRNA二组中GFP的表达特点（200×）

图3 SORBS1在不同组HUVEC中的相对表达量

图4 MDA含量在不同组HUVEC中的相对表达量

生理状态下，血管内皮细胞可以维持和调节血管系统的正常功能。研究表明，高同型半胱氨酸血症时，氧化应激亢奋对其损伤是导致动脉粥样硬化、发生发展的关键因素［6］。叶酸参与了蛋白质、嘌呤核苷酸和脱氧胸苷酸的合成和甲硫氨酸循环。维生素B12能够促进叶酸的循环利用，叶酸和维生素B12在蛋氨酸循环、细胞的生长分裂等方面具有协同作用。研究表明，补充叶酸、B族维生素能够降低血浆Hcy水平并改善血管内皮功能［7，8］。生物膜的脂质过氧化是活性氧等自由基介导的内皮细胞损伤的初级事件，丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）是评价VEC遭受氧化应激损伤严重程度的生物标志物，其升高直接反映VEC遭受了过度的氧化应激损伤［9］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）对内皮细胞维持氧化/抗氧化平衡状态起重要作用。真核生物的SOD根据所含金属辅基的不同分为含铜锌金属辅基的SOD，称为（CuZn-SOD，SOD1）和含锰金属辅基的SOD，称为（Mn-SOD，SOD2）两种，SOD1存在于细胞液中，SOD2存在于线粒体中，其中SOD2发挥着更重要的作用［10］。因此，MDA和SOD2是反映机体氧化应激状态的最重要指标。本室前期研究发现1mmol/L的Hcy作用于HUVEC，使其处于氧化应激亢奋状态，叶酸、维生素B12可以改善高同型半胱氨酸血症导致的细胞氧化应激亢奋状态，表明由于具有细胞毒性的脂质过氧化产物的增加以及细胞抗氧化功能的下降，可能共同导致了HUVEC的氧化应激损伤，证明了叶酸和维生素B12对Hcy诱导的HUVEC的氧化应激损伤具有保护性作用。

图5 SOD2在不同组HUVEC中的相对表达量

SORBS1（CAP/ponsin）、SORBS2（Argbp2）与SORBS3（Vinexin）属于衔接子蛋白家族，也被称为SOHO家族［11］。其中SORBS1是泛素连接酶Cbl的相关蛋白，SORBS1（CAP/Cb1）通路主要参与胰岛素信号转导，胰岛素信号通路功能障碍则会引发胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），并与高血压、脑梗死等疾病有关［5，12］，也可以使机体处于亚临床的轻微氧化应激状态，进而诱发机体呈持续的慢性炎症状态［13］，低度慢性炎症可进一步引发机体的氧化应激状态，导致更多的炎性细胞因子释放，炎症因子进而干扰胰岛素信号转导机制，加重IR，形成恶性循环。本研究结果显示，Hcy组的SORBS1基因甲基化程度明显高于空白对照组，提示Hcy可能通过引起蛋氨酸循环代谢异常，导致SORBS1基因表达调控的甲基化修饰，从而降低SORBS1的表达水平，使胰岛素信号通路功能障碍，导致胰岛素抵抗，介导HUVEC的氧化应激损伤。利用RNAi技术沉默靶基因的表达，能够迅速、准确地分析目标基因表达的改变对靶细胞各种生物效应的影响。有学者认为，siRNA不仅能够对目标基因的表达进行转录和转录后调控，还能够通过调控组蛋白的甲基化修饰状态进行调节［14］。为了进一步了解SORBS1分子，本研究结果显示，成功干扰抑制SORBS1的表达后，MDA的含量明显升高，而SOD2的mRNA和蛋白表达水平则明显降低，表明HUVEC细胞SORBS1基因沉默可以导致HUVEC出现氧化应激亢奋状态及其抗氧化能力降低的表现。因此，推断Hcy刺激HUVEC细胞后，使细胞的SORBS1基因呈高甲基化状态，不仅能够导致SORBS1参与的细胞胰岛素信号通路障碍，进而出现胰岛素抵抗现象；另外还能够诱导细胞出现氧化应激的亢奋状态，以及细胞抗氧化能力的降低。

综上，本研究初步揭示了Hcy通过调节SORBS1基因的甲基化水平诱导HUVEC发生氧化应激，进而造成血管内皮细胞损伤的机制。近年来，随着DNA甲基化调控动脉粥样硬化及有关脑梗死预后研究的增加［15］，为阐明脑梗死遗传和环境因素相互作用所导致的复杂性疾病的防治开拓了新思路。然而，研究表观遗传领域最大的难题是明确致病路径，Hcy诱导的SORBS1基因甲基化异常在脑梗死发病中是怎样发挥作用的仍有待进一步研究。