百事乐胶囊对皮质酮暴露大鼠海马神经元神经营养相关蛋白表达的影响

王华，凌佳，赵洪庆，3，蔺晓源，王宇红，3，孟盼，3

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；3.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208

抑郁症是最常见的严重精神障碍性疾病，具有睡眠障碍、缺乏兴趣等核心价值降低的特点。据世界卫生组织报告显示，全球现有抑郁症患者约3.4 亿，而中国作为全球抑郁症人数最多的国家其发病率高达4.2%[1]。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴是机体应激的调节系统，参与机体糖皮质激素的产生，并通过海马中糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）完成其负反馈调节。血清和糖皮质激素诱导激酶1（serum and glucocorticoid-induced kinase 1，SGK1）

是糖皮质激素信号系统的下游靶点[2]。采用海马神经前体细胞联合SGK1、GR 抑制剂，发现SGK1 是糖皮质激素降低海马神经元再生的下游位点；同时，SGK1 可能通过向下调节脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-3（NT-3）等神经营养蛋白从而影响海马神经元再生[3]。重度抑郁症患者外周血中SGK1 的表达明显上升，进一步说明SGK1 与抑郁症的发生密切相关[4]。百事乐胶囊由人参、贯叶连翘、姜黄组成，系具有独立自主知识产权的抗抑郁中药复方制剂，是根据中医理论及国内外治疗抑郁症的研究成果及一定的科研基础筛选拟定的临床经验方。前期研究表明，百事乐胶囊可显著改善慢性应激抑郁模型大鼠抑郁样行为学表现[5]，促进模型大鼠海马神经再生[6]，并能显著调节GR/SGK1 信号通路[7]。本实验以皮质酮暴露大鼠海马神经元为研究对象，以SGK1 信号和神经营养因子为切入点，进一步探究百事乐胶囊对海马神经元保护的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SPF 级SD 大鼠12 只，其中雌性（受孕18 d）3 只，体质量350～450 g，雄性9 只，体质量200～220 g，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号为SCXK（湘）2015-0003。其中雌性大鼠直接用于海马神经元原代取材，雄性大鼠饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF 级实验动物中心。

1.2 药物

百事乐胶囊，湖南省中医药研究院提供，0.38 g/粒，批号20140421；盐酸氟西汀胶囊，20 mg/粒，Patheon France，批号0722A。

1.3 主要试剂与仪器

皮质酮、L-多聚赖氨酸、DMSO（美国Sigma 公司），胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶（美国Amresco 公司），DMEM/F12 培养基、胎牛血清（美国Hyclone 公司），Neurobassal神经元基础培养基、B27添加剂、Glutamax（美国Gibco 公司），多聚甲醛（天津科密欧公司），兔抗烯醇化酶多克隆抗体（NSE）（中国Bioworld 公司），BDNF 多克隆抗体、NT-3 多克隆抗体、β-tublin多克隆抗体、DAPI、FITC 标记羊抗兔IgG、R-PE 标记羊抗小鼠IgG（英国Abcam 公司），神经生长因子（NGF）多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。CO48R-230 型三气细胞培养箱（New Brunswick Galaxy），OPERETTA 型高内涵成像分析系统（HCA，PerkinElmer），低温离心机（Eppendorf），超低温冰箱（青岛海尔），IX71 型倒置荧光相差显微镜（日本Olympus），S8PAO 型体视显微镜（美国Leica）。

1.4 药物血清制备

将SPF 级雄性SD 大鼠随机分为百事乐胶囊药物血清组、氟西汀药物血清组和空白血清组，每组3 只，分别对应给予临床有效3 倍量百事乐胶囊（4.32 g/kg）、盐酸氟西汀胶囊（16.2 mg/kg）、蒸馏水，2 次/d，连续3 d，按10 mL/kg 灌胃给药，末次给药后1 h 于无菌条件下腹主动脉取血，暂存于促凝管中，静置2 h，3000 r/min 离心15 min，吸取上清液，56 ℃水浴30 min灭活，0.22 μm 滤膜过滤，分装后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.5 海马神经元原代培养

GR/SGK1 信号通路参与学习、记忆和神经可塑性以及应激反应和抑郁症的发生[10]。持续应激状态下HPA 轴激活，导致糖皮质激素持续分泌，损伤海马神经元内GR并引起HPA轴负反馈失衡后的神经内分泌系统紊乱[11]。SGK1 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC亚家族成员，可参与细胞代谢、神经兴奋性、细胞增殖和凋亡及激素分泌等过程[12]。SGK1 在长时程记忆形成中扮演重要角色，SGK1 失活可损伤空间记忆及新事物的认知记忆[13]。研究表明，急性冷水游泳应激小鼠模型、反复注射皮质酮或地塞米松构建的抑郁样小鼠模型脑内SGK1 的表达均明显上调[14]。同时，抑郁症患者SGK1 mRNA 水平升高，与慢性应激抑郁模型动物SGK1 表达趋势相符[15]。SGK1 可通过糖皮质激素信号参与抑郁症的发生，并在无糖皮质激素的条件下潜在维持GR 活性，可反馈调控GR 的磷酸化水平，即SGK1 是HPA 轴负反馈调节的核心枢纽[16]。本研究发现，百事乐胶囊药物血清可显著降低皮质酮暴露海马神经元SGK1 的表达，与前期在体研究结果一致[7]，提示SGK1 是百事乐胶囊发挥良好抗抑郁功效的核心靶点之一。

BDNF、NT-3、NGF 是一类具有神经营养功能的小分子蛋白，可促进神经细胞存活，增加突触可塑性，对神经元的生长、发育、分化及功能维持具有重要作用[17]。研究发现，抑郁症患者血清中BDNF 水平明显低于健康人[18]，BDNF 基因敲除的小鼠表现出明显的快感缺乏和探索能力下降等抑郁样表现，且海马内神经元数目减少，树突长度和分枝复杂度下降[19]。何国琪等[20]发现慢性应激大鼠脑内NT-3 的表达显著下降，且伴随着神经元的凋亡。NGF 是神经营养素的另一个重要组成蛋白，抑郁症自杀者死后脑内NGF水平明显低于正常对照组。抑郁模型大鼠特定脑区NGF 水平显著降低，而给予氟西汀干预后NGF 水平显著升高[21]。本研究发现，皮质酮暴露条件下的海马神经元出现明显的树突连接断裂、神经网络复杂度降低等细胞损伤现象，并伴随着BDNF、NT-3、NGF的相对荧光强度降低；给予百事乐胶囊药物血清干预后，上述指标均有所逆转，提示百事乐胶囊可提高皮质酮暴露海马神经元的可塑性，改善神经营养丢失情况，进而发挥神经保护作用。

脑为元神之府，脑主神明而总统诸神。神明，包括精神、意识、思维活动，这其中也包括情志活动。若气血失调，元神失养，神机运转不利，就会导致反应迟钝、精神萎靡等抑郁症状的产生。百事乐胶囊是本课题组研发的抗抑郁中药制剂，方中姜黄活血化瘀、行气止痛，善破肝脾二经之血瘀气结，主血瘀气滞诸证；贯叶连翘具有疏肝解的功效，为臣药，取散诸结之意；人参大补元气、安神益智。全方具有理气活血、宁心安神功效。

基于抑郁症“单胺神经递质”假说的药物研发已成为目前抗抑郁的主流，但仍存在很大的限制。抑郁症“海马神经可塑性障碍”假说可为抗抑郁药物研发理论从传统转向新视野提供思路。围绕神经营养、神经可塑性、HPA 轴等药物作用的新靶标，从多环节、多途径着手研发抗抑郁中药复方将成为趋势。本研究发现，百事乐胶囊可通过SGK1 信号改善神经元的营养丢失、增加突触可塑性，进而发挥抗抑郁功效。